De fusion mitochondriale a été mesurée par le suivi de l'équilibrage de photoconverted matrice ciblée GFP à travers le réseau mitochondrial au cours du temps. Jusqu'à présent, une seule cellule pourrait être soumis à une analyse cinétique à long heure à une heure. Nous présentons une méthode qui permet de mesurer simultanément plusieurs cellules, ce qui accélère le processus de collecte de données.
Article de méthode
Plus rapide, à haute résolution, la MTPA-GFP basée sur Fusion test mitochondrial l'acquisition de données cinétiques de plusieurs cellules en parallèle en utilisant la microscopie confocale
Dans cet article
Résumé
Résumé
La fusion mitochondriale joue un rôle essentiel dans l'homéostasie calcique mitochondriale, la bioénergétique, l'autophagie et le contrôle de qualité. La fusion est quantifiée dans des cellules vivantes par la photoconversion de la GFP photoactivable ciblant la matrice (mtPAGFP) dans un sous-ensemble de mitochondries. La vitesse à laquelle les molécules photoconverties s'équilibrent au sein de l'ensemble de la population mitochondriale est utilisée comme mesure de l'activité de fusion. Jusqu'à présent, les mesures étaient réalisées selon une approche de laps de temps sur une seule cellule, en quantifiant l'équilibration dans une cellule sur une heure. Ici, nous amplifions et automatisons une méthode précédemment publiée sur des cellules vivantes, basée sur l'utilisation de mtPAGFP et d'une faible concentration de TMRE (15 nm). Cette méthode consiste à photoactiver une petite portion du réseau mitochondrial, à acquérir toutes les 15 minutes pendant 1 heure des séries d'images en coupes confocales hautement résolues, puis à quantifier les variations d'intensité du signal. Selon plusieurs facteurs tels que la facilité de repérer les cellules exprimant PAGFP et l'intensité du signal dans les régions photoactivées, il est possible d'acquérir environ 10 cellules dans chaque intervalle de 15 minutes. Cela permet une amélioration significative de l'efficacité temporelle de ce dosage tout en conservant une quantification subcellulaire hautement résolue ainsi que les paramètres cinétiques nécessaires pour capturer les détails du comportement mitochondrial dans son environnement cytoarchitectural d'origine.
La dynamique mitochondriale joue un rôle dans de nombreux processus cellulaires, notamment la respiration, la régulation du calcium et l'apoptose1,2,3,13. La structure du réseau mitochondrial influence la fonction des mitochondries ainsi que leur interaction avec le reste de la cellule. Soumis à une division et une fusion constantes, les réseaux mitochondriaux adoptent des formes variées, allant de réseaux fortement fusionnés à des réseaux plus fragmentés. Fait intéressant, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A et l'atrophie optique dominante ont été associées à une morphologie mitochondriale altérée, notamment à des réseaux fragmentés4,10,13. Souvent, après fragmentation, les mitochondries deviennent dépolarisées, et leur accumulation conduit à une altération de la fonction cellulaire18. La fission mitochondriale a été montrée comme un signal incitant la cellule à s'engager dans l'apoptose. Elle peut également fournir un mécanisme permettant de séparer les mitochondries dépolarisées et inactives afin de préserver la robustesse de l'ensemble du réseau14. La fusion mitochondriale, en revanche, permet le partage des protéines matricielles, des solutés, de l'ADN mitochondrial et du gradient électrochimique, et semble également empêcher la progression vers l'apoptose9. L'impact de la fission et de la fusion mitochondriales sur l'homéostasie cellulaire et, en fin de compte, sur le fonctionnement de l'organisme nécessite encore d'être mieux compris ; ainsi, le développement continu et l'optimisation des méthodes permettant de recueillir des informations sur ces phénomènes sont nécessaires.
Les dosages existants de fusion mitochondriale ont révélé diverses informations sur la physiologie mitochondriale, chacun présentant ses propres avantages. Le dosage de fusion par hybridation avec du PEG7 mélange deux populations de cellules marquées différemment (mtRFP et mtYFP), puis analyse le degré de mélange et de colocalisation des fluorophores dans les cellules fusionnées et multinucléées. Bien que cette méthode ait fourni des informations précieuses, tous les types cellulaires ne peuvent pas fusionner, et les conditions induisant la fusion impliquent l'utilisation de médicaments toxiques susceptibles d'affecter le processus normal de fusion. Plus récemment, une technique sans cellules a été mise au point, utilisant des mitochondries isolées pour observer les événements de fusion grâce à un dosage basé sur la luciférase1,5. Deux lignées cellulaires humaines sont modifiées pour exprimer soit la partie amino-, soit la partie carboxy-terminale de la luciférase de Renilla, associée à un fermeture éclair de leucine afin d'assurer la dimerisation lors du mélange. Des mitochondries sont isolées à partir de chaque lignée cellulaire, puis fusionnées. La réaction de fusion peut se produire en l'absence de cytosol, dans des conditions physiologiques, en présence d'énergie, à une température appropriée et avec un potentiel de membrane mitochondriale interne. Fait intéressant, on a observé que le cytosol module l'ampleur de la fusion, démontrant ainsi que la signalisation cellulaire régule ce processus4,5. Ce dosage s'avérera très utile pour des criblages à haut débit visant à identifier les composants du mécanisme de fusion, ainsi que des composés pharmacologiques pouvant influencer la dynamique mitochondriale. Toutefois, des dosages mitochondriaux plus détaillés réalisés sur des cellules entières seront nécessaires pour compléter ce dosage in vitro et observer ces événements dans un environnement cellulaire.
Une technique permettant de surveiller la dynamique mitochondriale au niveau de la cellule entière est utilisée depuis un certain temps et repose sur une GFP photoactivable ciblant spécifiquement les mitochondries (mtPAGFP)6,11. Après expression de la mtPAGFP, une petite portion du réseau mitochondrial est photoactivée (10-20 %), et la propagation du signal vers le reste du réseau mitochondrial est enregistrée toutes les 15 minutes pendant 1 heure à l’aide d’une imagerie confocale en laps de temps. Chaque événement de fusion entraîne une dilution de l’intensité du signal, permettant ainsi de quantifier la fréquence de fusion. Bien que la fusion et la fission se produisent continuellement dans les cellules, cette technique ne surveille que la fusion, car la fission n’entraîne pas de dilution du signal PAGFP6. Un double marquage avec de faibles concentrations de TMRE (7-15 nM dans les cellules INS1) permet de quantifier le potentiel de membrane des mitochondries. Lorsque les mitochondries sont hyperpolarisées, elles accumulent davantage de TMRE, et lorsqu’elles se dépolarisent, elles perdent le colorant TMRE. Les mitochondries dépolarisées ne possèdent plus un potentiel membranaire suffisant et ont tendance à ne plus fusionner efficacement, voire pas du tout. Par conséquent, les mitochondries actives en cours de fusion peuvent être suivies à l’aide de ces faibles concentrations de TMRE9,15. L’accumulation de mitochondries dépolarisées dépourvues de signal TMRE peut être un signe de phototoxicité ou de mort cellulaire. Des concentrations plus élevées de TMRE rendent les mitochondries très sensibles à la lumière laser, et il convient donc d’être particulièrement prudent afin d’éviter un surmarquage avec le TMRE. Si l’effet de la dépolarisation mitochondriale est l’objet d’intérêt, une technique utilisant des concentrations légèrement plus élevées de TMRE et une lumière laser plus intense peut être employée pour dépolariser les mitochondries de manière contrôlée (Mitra et Lippincott-Schwartz, 2010). Afin de s’assurer que la toxicité liée au TMRE ne pose pas de problème, nous recommandons d’exposer les cellules chargées (3-15 nM de TMRE) aux paramètres d’imagerie qui seront utilisés dans le test (par exemple, 7 séries de 6 sections optiques consécutives) et d’évaluer la viabilité cellulaire après 2 heures. Si les mitochondries apparaissent trop fragmentées et que les cellules meurent, d’autres marqueurs mitochondriaux, tels que dsRED ou Mitotracker red, pourraient être utilisés à la place du TMRE.
La méthode mtPAGFP a révélé des détails sur le comportement du réseau mitochondrial qui ne pouvaient pas être visualisés à l’aide d’autres méthodes. Par exemple, on sait désormais que la fusion mitochondriale peut être complète ou transitoire, permettant dans ce cas un mélange du contenu matriciel sans modification de la morphologie globale du réseau. De plus, on sait que la probabilité de fusion est indépendante de la durée du contact et des dimensions des organites, mais qu’elle est influencée par la mobilité des organites, le potentiel membranaire et l’historique des activités de fusion antérieures8,15,16,17.
Dans cet article, nous décrivons une méthodologie permettant d'augmenter l'échelle du protocole précédemment publié utilisant le mtPAGFP et du TMRE à 15 nM.8 afin d'examiner plusieurs cellules simultanément et d'améliorer l'efficacité temporelle de la collecte des données sans sacrifier la résolution subcellulaire. Ceci a été rendu possible grâce à l'utilisation d'une platine motorisée de microscope et d'un logiciel d'acquisition d'images programmable. Le logiciel Zen de Zeiss permet à l'utilisateur de marquer et de suivre plusieurs cellules désignées exprimant la protéine mtPAGFP. Chacune de ces cellules peut être photoactivée dans une région d'intérêt particulière, et des séries de coupes confocales peuvent être surveillées pour le signal de mtPAGFP ainsi que pour celui du TMRE à des intervalles prédéfinis. D'autres systèmes confocaux pourraient être utilisés pour réaliser ce protocole, à condition qu'ils soient équipés d'une platine automatisée et programmable, ainsi que d'un incubateur avec CO2, et un moyen d'activer la PAGFP par photoactivation ; soit un laser multiphoton, soit un laser à diode de 405 nm.
Protocole
1. Préparation plaque image
- Culture Ins1 cellules RPMI contenant 10% sérum de veau fœtal norme, 1% de pénicilline-streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 50 uM de 2-mercaptoéthanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM d'HEPES, 2 mM d'acide pyruvique, et 11 mM de glucose à 80% de confluence.
- Trypsiniser les cultures de cellules Ins1 avec de la trypsine 0,05% et la plaque-les sur la poly-D-lysine plaques revêtues d'imagerie lamelle à fond (% de confluence 30-40).
- Autoriser pour les plaques pour atteindre la confluence de 60-80% (environ 2 jours) et ajouter de la matrice mitochondriale ciblé (COXVIII) adénoviral PA-GFP pendant 24 heures (MOI = 5). Les médias de change et permettent aux cellules de croître pendant encore 2 jours avant l'imagerie.
- Le jour de l'imagerie, ajouter 7-15 TMRE nM à des plaques d'imagerie, et s'équilibrer pendant au moins 45 min.
- Durant ce tour de temps sur l'incubateur (étage supérieur incubateur a été utilisé ici) et permettre le microscope à s'équilibrer à 37 ° C pendant environ 1 heure. Allumez le 5% de CO 2.
2. Paramètres d'imagerie pour l'Zeiss LSM 710 Microscope confocal
- Après le microscope a équilibré, sous l'onglet Acquisition, cliquez sur "outils" manuel montrent, ouvrez l'imagerie mis en place un groupe spécial, et choisissez "mode de canal" et passer le suivi de chaque "frame".
- Dans le panneau trajet de la lumière, choisissez LSM et le mode de canal. De travail de l'icône vers le haut spécimen, sélectionnez "arrière", MBS 690 +, et MBS 488. Au bas du panneau, choisissez "T-PMT" pour permettre la visualisation du champ lumineux ou d'un canal DIC.
- Terminer le réglage des paramètres de chemin de lumière en définissant la plage pour le colorant GFP à 490-540 nm et 580-700 nm pour à la teinture TMRE.
- Dans le mode d'acquisition, d'utiliser un 512 × 512 pixels champ de balayage, 4x moyenne, et choisissez un facteur de zoom (que vous pouvez vouloir garder cohérente à des fins d'étalonnage).
3. Optimiser les paramètres d'imagerie
- Utilisation de la apochromatique plan de 100x (1,4 NA) objectif, focnous sur vos cellules avec la lumière halogène, pas une lumière fluorescente, pour protéger les mitochondries de phototoxicité.
- Écran pour PA-GFP cellules exprimant l'aide d'un sténopé ouverture maximale et la numérisation pour trouver les cellules qui sont plus lumineux vert.
- Trouver la plus faible puissance du laser 2-photons nécessaire pour activer le PA-GFP et d'optimiser les paramètres d'imagerie veillant à ce que le signal ne sature pas le détecteur. Vérifiez que le signal PA-GFP co-localise avec le signal TMRE pour quelques z-series. La perte du signal TMRE indique dépolarisation mitochondriale ou de la phototoxicité, et les cellules présentant ces caractéristiques ne doivent pas être utilisés pour l'analyse.
- Trouver une cellule PA-GFP exprimer et de spécifier un facteur de zoom.
- Définissez la plage de la série Z de recueillir 6 tranches (cette gamme aura besoin pour satisfaire l'ensemble des 10 cellules, sauf si un particulier z-focus est défini à chaque position).
- Enregistrer la méthode d'imagerie, pour chaque cellule (cellule 1, cellule 2, etc).
4. Réglez le AutomatePortion d du Programme et de désigner les 10 cellules que vous suivrez pour le dosage de 1 heure Fusion mitochondriale
- Sur le panneau gauche de la fenêtre MultiTime, sélectionnez l'option "économie" du panneau, et spécifiez l'emplacement où les fichiers seront sauvegardés.
- Dans l '"acquisition" du panneau, de charger la méthode d'acquisition enregistrés pour la cellule 1 dans la configuration de numérisation et cochez la case pile z. Vous pouvez aussi choisir "marqué Z-milieu de pile z".
- Dans le "blocs" du panneau, sélectionnez "seul bloc à chaque endroit». Cliquez sur "ajouter" pour les blocs de chaque intervalle à mesurer.
- Dans le "timing" du panneau, sélectionnez "attendre l'intervalle" et tapez "0" dans le "délai d'attente avant le bloc au premier emplacement seulement". Blocs 2-4 aura "15 min" dans cette section.
- Dans le panneau Emplacement, choisissez "déplacer le focus pour charger la position entre les emplacements" et "charge numériser config quand« passer à loc »ou« la prochaine loc 'cliqué. Dans le cadre du "endroits Modifier la liste" choisir "effacer tout", puis sélectionnez «multiple endroits motorisé stade ".
- Under la "Bleach" panel, cliquez sur le "blanchiment" boîte, et de désigner le fichier de configuration dans le répertoire "config" dans le menu déroulant, tel que désigné dans la fenêtre principale du logiciel. Puis, dans le "blanchiment" fenêtre, enregistrer la méthode appropriée photoactivation. Dans le panneau régions, choisissez le retour sur investissement pour cette cellule particulière, et d'ajouter cette ROI à l'MultiTime en choisissant "add région actuelle à la liste ROI" fenêtre. Veillez à sélectionner l'emplacement même dans le "ROI" dans le menu déroulant.
Pour le moment pour fonctionner correctement et pour chaque cellule d'avoir un intervalle de 15 minutes, deux méthodes ont besoin d'être sauvé. Dans la liste des blocs, le premier aura la configuration «réel» photoactivation, et le reste aura une "maquette" de configuration qui n'utilise pas le laser à deux photons. Le premier bloc sera également le seul bloc qui n'a pas de retard (BKIntv = 0). Par conséquent, la méthode commence par un balayage de base, suivie d'une analyse photoactivation. Le reste des blocs ont une 900 sec BkIntv, età chaque point temporel, il ya deux balayages comme au temps 0 s, afin de maintenir la cohérence de synchronisation.
- Pour chacune des 10 cellules à suivre au fil du temps, d'effectuer cette séquence:
Trouvez une cellule exprimant PAGFP-sauver sa méthode d'imagerie
Lieu panneau marquer la position stade, préciser la méthode d'imagerie
Principal ROI panneau choisir une région d'intérêt à Bleach photoactivé panneau enregistrer un retour sur investissement spécifique et de le charger dans la boîte de retour sur investissement:
Effacer le retour sur investissement et de réinitialiser le zoom de balayage à 1
Trouvez la cellule suivante et régler le zoom
Répétez le processus pour les 9 prochains cellules
Vérifiez que chaque emplacement scène et tous les blocs ont la méthode d'imagerie appropriée (scanner de configuration) associé. Assurez-vous également que le premier bloc à chaque endroit correspond à la méthode appropriée photoactivation tandis que le reste contenir une "maquette" méthode. Enfin, sélectionnez «Exécuter».
5. Analyser l'intensité du signal PA-GFP
- Pour les cellules dans lesquelles le signal photoactivable-GFP co-localise avec le signal TMRE rouge, il faut soustraire le fond dans les images PAGFP (ici nous utilisons metamorph).
- Puis exporter les données vers Excel et calculer l'intensité moyenne de z-piles à chaque instant. Supprimer sections optiques qui n'ont pas de signal.
- Mesurer la dilution du signal dans chaque z-pile en calculant le pourcentage du signal original photoactivé.
Chaque point de données est numérisé et enregistré deux fois, résultant en double z-stack informations pour chaque point dans le temps. Vérifier que les valeurs z-stack d'accord. Si ce n'est pas, ce qui est révélateur d'un problème (par exemple la cellule accent mouvement,).
6. Les résultats représentatifs
Lorsqu'un événement se produit la fusion entre une activé et non activé PA-GFP mitochondrie, l'intérieur de la matrice PAGFP mitochondriale mélange avec la matrice non marqué et devient diluée sur une grande surface, diminuant le signalintensité (figure 1A). Dans la cellule INS1, une diminution significative de l'intensité du signal se produit toutes les 15 minutes, jusqu'à ce que l'équilibrage de la fusion mitochondriale a été atteint (environ 1 heure). Notez que la cellule dans la figure 1B présente colocalisation presque complète de PA-GFP et les signaux TMRE. Dans ces essais une très faible concentration de TMRE (15 nM) est utilisé pour aider à cibler la photoactivation de PAGFP, et aussi pour surveiller la santé des cellules. Les cellules avec une abondance de mitochondries dépolarisée aura colocalisation incomplète de PAGFP et TMRE et ne doit pas être analysé, car cela indique soit la phototoxicité, ou des cellules dans un état de mourir.
Le temps d'équilibrage pour la fusion mitochondriale est généralement de 1 h dans Ins1 cellules, quand ~ 15% du volume mitochondrial est activé. Parfois, même si une petite zone est éclairée, la plupart des mitochondries deviennent photoactivé en raison d'être hautement en réseau, dans ce cas de fusion plus difficile à détecter. D'autres types cellulaires peuvent présenter des temps d'équilibrage différents et devraient être testés à des intervalles plus courts et sur une plus longue période pour caractériser la dynamique mitochondriale. Pour inhiber la fusion mitochondriale, les cellules peuvent être placés dans un environnement lipotoxic. Il a été précédemment démontré que 0,4 mM de palmitate fragments mitochondries, et inhibe la fusion mitochondriale 9. Cet effet peut être vu dans la figure 2, où les mitochondries sont fragmentées, mais l'intensité du signal de l'mtPAGFP ne change pas autant que dans des conditions normales (Figure 1). Par conséquent, la dilution du signal PA-GFP est susceptible d'être due à la fusion mitochondriale plutôt que la fission. Dans les types d'autres cellules, nous vous suggérons d'utiliser d'autres moyens connus pour induire la fragmentation mitochondriale, comme faire taire OPA1 qui est nécessaire pour la fusion mitochondriale 14.
Figure 1. dilution typique du signal PA-GFP après photoactivation au cours d'une épreuve de fusion mitochondriale. A. PA-GFP devient progressivement gradateur en raison d'événements de fusion mitochondriales conduisant à la dilution de la protéine sur une surface croissante comme on peut le voir sur ces images projetées de 6 sections optiques quantifié toutes les 15 minutes. B. TMRE avec le PA-GFP montre que les mitochondries sont actives et non dépolarisée. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Fusion mitochondriale inhibée par 0,4 mM de palmitate diminue la dilution de PA-GFP. Projections A. de 6 sections optiques montrant mitochondries court avec une intensité de signal immuable au fil du temps. Colocalisation B. PA-GFP avec TMRE montre que les mitochondries ne sont pas depolarisée. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Discussion
Cette méthode permet l'imagerie de près de 10 cellules à la fois, si l'acquisition se produit toutes les 15 minutes après photoactivation. Le nombre exact de cellules dépendra de la rapidité avec laquelle on est capable de localiser et de marquer les cellules exprimant mtPAGFP au sein de la boîte de culture, et comment on peut rapidement mettre en place tous les paramètres du logiciel. Pour l'automatisation le bon déroulement d'une couche même de cellules doit être utilisé parce que les désignés Z-stack marges s'appliquera pour toutes les cellules.
La taille de cette zone photoactivation initiale régira le temps d'équilibration. Pour être capable de mesurer la fusion mitochondriale, il est important de photoactiver seulement 10-20% du réseau, tels que la propagation du signal au reste du réseau peut être suivi dans le temps. Si elle est trop grande partie du réseau est photoactivé, il est possible que la fusion complète aura lieu trop rapidement, et l'événement ne sera pas capturé.
Un soin extrême doit être prise àajuster la puissance du laser du laser à deux photons ainsi que la concentration TMRE pour éviter phototoxicité qui conduit à une dépolarisation mitochondriale. Veiller à ce que le signal mtPAGFP co-localise avec le signal TMRE peuvent aider à évaluer la phototoxicité et la santé des cellules en général 8,15. Illumination avec la lumière epifluoerescent devrait être évitée. Alors que la recherche de cellules exprimant mtPAGFP, le sténopé doit être au maximum ouvert pendant le balayage avec une excitation 488nm à faible puissance. Réglage de la puissance du laser à deux photons pour photoactiver assez PA-GFP pour mesurer le signal de plus de 1 heure, mais de ne pas saturer l'une des cellules peut être difficile 8. Cependant, le temps devrait être consacré à cette étape parce que le programme d'optimisation automatisée est une fois commencé, il est fastidieux de l'arrêter, pour choisir d'autres cellules, et de reprendre.
Pour le contrôle qualité, l'acquisition d'un contraste d'interférence différentiel (DIC) image (ou lumière transmise) pour surveiller l'accent mis sur les cellules peuvent être trèsutile et aussi un bon moyen pour détecter les bulles formées dans l'huile d'immersion lors de la numérisation, ce qui arrive parfois à partir des mouvements de la scène.
Bien que l'utilisation de cette méthode mtPAGFP recueille des données sur le mouvement unidirectionnel de protéines de la matrice des mitochondries de mitochondries photoactivé à ceux qui ne sont pas étiquetés, il est concevable d'utiliser cette technique pour étudier les processus d'autres. Par exemple, fluorochromes spécifiques peuvent être fixés à des protéines membranaires d'observer leur mouvement spécifique lors d'événements de fusion, comme cela a été montré pour ABC-moi, la fusion de ce qui se produit sur une échelle de temps différente du mélange de protéines de la matrice solubles 15.
Déclarations de divulgation
La production et l'accès gratuit à cet article est sponsorisé par Zeiss, Inc
Remerciements
Nous remercions le Centre Tufts pour la recherche en neurosciences, P30 NS047243 (Jackson), les mitochondries de la recherche collaborative d'affinité (mtARC) soutenu par le Centre pour la recherche biomédicale Evans interdisciplinaire à l'Université de Boston Campus médical, médecine Société Lien, et Zeiss pour soutenir ce travail.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| COXIII-adénoviral PA-GFP | Dr Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocale | Zeiss |
Références
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Réimpressions et autorisations
