Mise en place de cultures microbiennes eucaryotes à partir d'un enrichissement chimique stratifié lac Antarctique et de l'évaluation du potentiel de fixation du carbone

Résumé

Eucaryotes microbiens sont à la fois une source de carbone photosynthétique dérivé et principales espèces prédatrices en permanence lacs antarctiques couvertes de glace. Ce rapport décrit une approche de la culture d'enrichissement d'isoler métaboliquement eucaryotes microbiens polyvalents du lac de l'Antarctique, le lac Bonney, et évalue le potentiel de fixation du carbone inorganique en utilisant un dosage radio-isotope pour ribulose-1 ,5-oxygénase bisphophate carboxylase (RubisCO) l'activité.

Résumé

Du lac Bonney est l'un des nombreux permanence couvertes de glace des lacs situés dans les vallées sèches de McMurdo, en Antarctique. La couverture de glace pérenne maintient une colonne d'eau chimiquement stratifié et à la différence des organes intérieurs autres cours d'eau, empêche dans une large entrée externe de carbone et des nutriments provenant de flux. Biote sont exposés à de nombreux stress environnementaux, y compris l'année carence en éléments nutritifs graves, les basses températures, de l'ombre extrême, hypersalinité, et 24 heures l'obscurité pendant l'hiver ^1. Ces conditions environnementales extrêmes limiter le biote du lac Bonney presque exclusivement aux micro-organismes ^2.

Eucaryotes microbiens unicellulaires (protistes appelé "") sont des acteurs importants dans le cycle biogéochimique global ³ et jouer un rôle écologique important dans le cycle du carbone dans les lacs des vallées sèches, occupant les deux rôles primaires et tertiaires dans la chaîne alimentaire aquatique. Dans les vallées sèches aquatiques alimentaires web, protistes que je fixede carbone norganic (autotrophie) sont les principaux producteurs de carbone organique pour les organismes organotrophes ^{4, 2.} Phagotrophic ou protistes hétérotrophes capables d'ingérer les bactéries et les petits protistes agir comme les grands prédateurs dans la bande ⁵ aliments. Enfin, une proportion inconnue de la population protiste est capable de métabolisme mixotrophe combiné ^{6, 7.} Mixotrophie dans protistes implique la capacité de combiner la capacité photosynthétique à l'ingestion de micro-organismes phagotrophic proies. Cette forme de mixotrophie diffère du métabolisme mixotrophe en espèces bactériennes, ce qui implique généralement des molécules d'absorption du carbone dissous. Il ya actuellement très peu de protistes isolats de permanence de la glace-capped lacs polaires, et les études de la diversité des protistes et de l'écologie dans cet environnement extrême ont été limitées ^{8, 4, 9, 10, 5.} Une meilleure compréhension de la polyvalence métabolique protiste dans le web vallée simples aliments secs lac contribuera à l'élaboration de modèles pour la role des protistes dans le cycle global du carbone.

Nous avons utilisé une approche de la culture d'enrichissement d'isoler protistes phototrophes et potentiellement mixotrophe du lac Bonney. Profondeur d'échantillonnage dans la colonne d'eau ont été choisis en fonction de l'emplacement de la production primaire des maxima et des protistes la diversité phylogénétique ^{4, 11,} ainsi que la variabilité dans les grands facteurs abiotiques qui affectent les modes trophiques protistes: profondeurs d'échantillonnage peu profonds sont limitées pour les principaux éléments nutritifs, alors que la profondeur d'échantillonnage plus profondes sont limitées par la disponibilité en lumière. En outre, des échantillons d'eau des lacs ont été complétées par plusieurs types de milieux de croissance pour favoriser la croissance d'une variété d'organismes phototrophes.

RubisCO catalyse l'étape cinétiquement limitante dans le Bassham Calvin Benson (CBB) du cycle, la principale voie par laquelle les organismes autotrophes fixent le carbone inorganique et de fournir de carbone organique pour les niveaux trophiques supérieurs des réseaux trophiques aquatiques et terrestres ^12. Dans cette étude, we appliqué un test de radio-isotopes pour la modification de ¹³ échantillons filtrés pour surveiller l'activité maximale carboxylase comme un proxy pour le potentiel de fixation du carbone et la polyvalence métabolique dans les cultures du lac Bonney les enrichissement.

Protocole

1. L'acquisition des échantillons

1. Choisir et préparer le site d'échantillonnage un jour avant l'échantillonnage de la colonne d'eau. Cela permettra aux couches stratifiées de la colonne d'eau à la réforme après la perturbation due au forage et à la glace-trou de fusion. Identifier l'emplacement du site de forage par GPS.
2. Pour accéder à la colonne d'eau, commencez par percer un trou dans la glace avec une tarière à glace Jiffy attaché à une prolongation de 4 pouces Jiffy vol et peu de coupe. Pour prévenir le gel de la perceuse dans le trou, essayez d'éviter de forage dans l'eau liquide par l'arrêt de forage d'environ 4-6 cm au-dessus du haut de la colonne d'eau.
3. Le trou de forage devra être élargi à partir d'un diamètre de 15 à 60 cm avant l'échantillonnage. Ceci est réalisé par utilisation d'un générateur trou (Modèle Hotsy) qui circule polyéthylèneglycol chauffé à travers un tube de cuivre. Trou de fusion prend habituellement jusqu'à 18 heures.
4. Avant l'échantillonnage de la colonne d'eau, veiller à ce que tous les équipements requis et st l'échantillonOrage bateaux sont assemblés sur le site d'échantillonnage. Matériaux d'échantillonnage comprennent: bouteille Niskin (capacité L 5-10), avec la profondeur Winch-calibré par câble, Messenger, bouteilles d'échantillon suffisant pour chaque profondeur d'échantillonnage et de refroidisseurs pour le transport des échantillons.
5. Commencer l'échantillonnage tôt dans la journée (~ 5 heures), que le filtrage de l'eau des lacs devrait être achevée le jour de l'échantillonnage. Prélever des échantillons d'eau (1-5 L) à des profondeurs désirées (pour cette étude: 6-m, 15 m et des profondeurs d'échantillonnage de 18 m, mesurée à partir du niveau de l'eau piézométrique dans le trou dans la glace) à l'aide d'un échantillonneur Niskin attaché à un calibré treuil à main. Pour éviter une perturbation de la colonne d'eau de recueillir de faibles profondeurs avant plus profonds.
6. Magasin échantillons lacustres dans les refroidisseurs et de transport à partir du site échantillon au laboratoire champ à l'aide d'un traîneau attaché à un VTT (véhicule tout terrain). Les échantillons doivent être traités ou stabilisés (pour exemple: gel rapide dans l'azote liquide) au laboratoire échantillonnage sur le terrain immédiatement après.

2. Development des cultures d'enrichissement

1. Pour la culture de cultures d'enrichissement, de 0,5 à 1 L Concentré d'eau du lac sur 47 mm filtres 0,45 um pores de taille à l'aide de filtration polyéthersulfone douce (<0,3 atm). Si la diversité de la communauté naturelle est souhaitée, filtrer une deuxième échantillon sur 47 mm 0,45 um pores des filtres de polyéthersulfone taille et suivre les protocoles en fonction de Bielewicz et al. ⁴ pour eucaryote diversité phylogénétique.
2. Transfert filtre à Falcon de 50 ml tube stérile contenant ~ 20 ml d'eau du lac filtrée recueillies auprès de la profondeur d'échantillonnage que le filtre. Lavez délicatement les cellules du filtre à l'aide d'une pipette stérile.
3. Transfert suspension cellulaire à un ballon de 25 cm ² de culture cellulaire stérile. Ajouter l'eau du lac filtrée recueillies auprès de chaque profondeur de l'échantillon pour augmenter le volume de la culture à 45 ml. Mettre en place plusieurs répétitions pour chaque profondeur d'échantillonnage, si enrichissements sur différents milieux de culture sont souhaitées.
4. Supplément flacons de culture avec 50X ssolutions terile à une concentration finale de 1X des milieux de culture suivants: Moyen basale Bold, BG11 et F / 2. Si la culture d'organismes mixotrophes est nécessaire, le démarrage deux navires F/2-supplemented et ajouter 2-3 grains de riz stérile l'une quelconque des flacons.
5. Incuber flacons de culture à basse température (4 ° C) et sous faible éclairement (20 umol photons m ^-2 s ^-1) dans une croissance à température contrôlée incubateur pour au moins 4 semaines dans l'Antarctique avant l'expédition de votre laboratoire américain. Si des isolats sont souhaités, la plaque 250 uL de culture d'enrichissement sur gélose contenant un milieu de croissance approprié, après une incubation de 2 semaines.
6. Pour l'expédition aux États-Unis, les cultures d'enrichissement de transfert aux stériles de 50 mL tubes Falcon. Exigence d'expédition Demande de "ne pas congeler" et "Keep cool" sur le transport de la demande. Alors que le processus d'expédition de l'Antarctique est relativement rapide (2 semaines par voie aérienne commerciale) et très fiable, il ya une possibilité de perte de l'organe fastidieuxismes au cours du processus de transport. Ainsi, les enquêteurs peuvent vouloir préserver un sous-échantillon avant l'expédition de sorte que la perte de certaines espèces au cours du processus d'expédition peut être évaluée.
7. À l'arrivée aux États-Unis, le transfert de 5 ml de la culture d'enrichissement dans 45 ml de milieux de croissance appropriés dans une fiole Erlenmeyer de 125 ml stérile coiffé d'une éponge stérile. Cultures d'enrichissement devrait être maintenu comme debout cultures à une température contrôlée en chambre de croissance de l'environnement (Chambre de croissance diurne, VWR) à 4 ° C/20 photons umol m ^-2 s ^-1. Les cultures doivent être transférés sur des supports tous les 30 jours.

3. Extraction lysat cellulaire à partir enrichissements filtrées

1. Filtre 5 ml de la culture d'enrichissement sur un 25 mm Whatman GF / F filtre à l'aide léger vide (moins de 10 psi). Le filtre peut être stocké pendant plusieurs semaines à -80 ° C avant dosage de l'activité Rubisco.
2. Coupez le filtre en sections avec des ciseaux en acier 4-5 stériles ettransférer les pièces avec une pince stérile à un tube 2 ml bouchon à vis remplie d'un cinquième de la voie complète avec 0,1 mm de diamètre de zircone / silice billes.
3. Ajouter 1,25 ml de tampon d'extraction de filtre (50 bicine, 10 mM MgCl _2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, et 0,1% de triton X-100, ajouter frais: 10 mM NaHCO _3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocaproïque l'acide, 0,7 mM de benzamidine, pH 7,8) ¹³ et de perturber les cellules en utilisant un batteur Minibead trois fois pour 30 ans sur 48 réglage de la vitesse. Pour éviter un échauffement de l'échantillon, beadbeating alternent avec une incubation de glace min.
4. Centrifugeuse suspension filtre pendant 2 minutes à 3000 x g à 4 ° C pour former une boulette de lâche GF / F fibres filtrantes et les débris paroi cellulaire.
5. Suppression d'un aliquote de 200 ul et plongez dans 800 ul de acétone glacée 90%. Mesurer la chlorophylle extractible (chl) a dans un spectrophotomètre à des valeurs de longueur d'onde de 664 nm et 647 nm ^14. Transférer le surnageant dans un microtube de 1,5 mL.
6. Centrifuger remaining surnageant à 4 ° C pendant 2 min à 15.000 xg et de transférer le surnageant (éviter le culot de membranes cellulaires insolubles et autres GF / F fibres du filtre) à un propre de 1,5 ml microtube. Ce lysat cellulaire soluble peut maintenant être utilisé dans le dosage RubisCO activité carboxylase.
7. Lysat peut être conservé à -80 ° C après addition de glycérol de 12,5% et la congélation instantanée dans l'azote liquide. Une perte d'activité peut se produire après plusieurs cycles gel / dégel en fonction de la sensibilité des enzymes dans le lysat. Par conséquent, l'activité de lysat frais versus congelée doit être examinée avant à grande échelle des extractions lysat cellulaire.

4. RubisCO Assay carboxylase filtrer l'activité

1. Transfert 125 ul de lysat soluble à un tube de 15 ml vis microcentrifugeuse bouchon (bouchon n'est pas nécessaire) qui a été sur de la glace. Pour les échantillons de contrôle négatifs, ajouter 125 ul de lysat soluble à tube de 15 ml vis microcentrifugeuse bouchon, mais n'ajoutez pas de substrat (à l'étape 4.7). Courirreproduire les réactions de tous les échantillons et les contrôles négatifs.
2. Préparer 10 ml de tampon de dosage frais (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO _3, 25 mM MgCl ₂₎ et le froid sur la glace. Aliquoter assez de la mémoire tampon de dosage pour tous les échantillons et les contrôles négatifs (100 pi par échantillon / contrôle de plus 100 supplémentaires pi) à un tube de 5 ml. Effectuer toutes les étapes ultérieures sous une hotte.
3. Ajouter 40 ul NaH ¹⁴ CO ₃ (500 pCi / ml) par ml de tampon d'essai à la mémoire tampon poolées et de garder la mémoire tampon sur la glace.
4. Retirez 10 uL du tampon de dosage contenant ¹⁴ C et la diluer dans 1 ml de tampon de dosage. Après inversion de mélanger, ajouter 100 ul du mélange dilué 1:100 à 3 ml de Bio-sécurité à scintillation comptage II cocktail dans un flacon à scintillation. Mélanger par inversion. Compte de scintillation (Beckman LS6500) devrait être plus de 18.000 cpm avant de poursuivre avec le test.
5. Quand un nombre suffisant de NaH ¹⁴ CO ₃ a été ajouté à la mémoire tampon de dosage,déplacer les tubes de réaction à un bain sec préréglée à 25 ° C et incuber pendant 3-5 min.
6. Ajouter 100 ul du tampon d'essai à des lysats et incuber pendant 5 minutes à 25 ° C.
7. Ajouter 20 ul de 15 mM ribulose biphosphate, à des échantillons et permettre à la réaction se poursuivre pendant 5-10 minutes à 25 ° C.
8. Ajouter 100 ul d'acide propionique (100%) (Fisher) pour arrêter la réaction. Centrifuger pendant 1 heure à 2000 xg à épuiser non constituée en société ¹⁴ C.
9. Transférer le volume total des échantillons dans des flacons à scintillation contenant 3 ml de Bio-Safe II cocktail de scintillation comptage. Déterminer cpm de produits acides finaux stables par comptage à scintillation (B. de Witte, R. Tabita communication personnelle).
10. Calculer les taux d'activité Rubisco sur un chl une base ^14.

5. Les résultats représentatifs

Nous avons utilisé la culture d'enrichissement d'isoler phototrophes adapté au froid et protistes mixotrophes résidant dans le L 'AntarctiqueAke Bonney. Pour capturer une plus grande diversité d'organismes, nous avons testé trois types de milieux de culture: Moyen basale Bold (BBM) ^15, F/2-Si Marine Medium ^{16, 17} et BG11 moyen ^{de 18 ans.} L'inspection visuelle des cultures d'enrichissement par microscopie optique a révélé que les cultures ont été dominées par les protistes phototrophes (indiqué par la présence de pigments chlorophylliens dans la plupart des cellules) et nourrissait une grande variété de morphologies cellulaires en fonction de la profondeur d'échantillonnage à partir de laquelle l'inoculum a été prise et le type de support utilisé dans la culture (fig. 1).

Nous avons mesuré les taux maximaux d'activité carboxylase catalysées par l'enzyme rubisco comme un proxy pour le potentiel de fixation du carbone. Chl une abondance a également été suivie que d'une estimation de la biomasse des protistes phototrophes (Fig. 2). Malgré la culture de toutes les cultures dans le cadre du même température / lumière régime (c.-à-4 ° C/20 mol m ^-2 s ^-1), le potentiel de fixation du carboneet la biomasse phototrophes variait considérablement entre les cultures d'enrichissement. Maximum RubisCO activité a été observée dans des cultures d'enrichissement de croissance dans les deux BBM (enrichissements 4 et 6) ou BG11 (enrichissements 13 et 14) des milieux de croissance, tandis que les cultures sur milieu de croissance enrichi F / 2 (enrichissements 19, 21, 23) ont présenté une 4 - à la baisse de 34 plis activités carboxylase maximum. Ces différences n'étaient pas dues à des niveaux inférieurs de la biomasse dans les cultures F / 2, que l'activité carboxylase a été exprimé sur une base Chl. En outre, l'activité RubisCO n'était pas corrélée avec une concentration chl (r = -0,023, p> 0,1;. La figure 2, en médaillon). Les cultures BBM inoculés avec l'eau du lac à partir de 6 m et 15 m (enrichissements 4 et 5) ont eu le plus grand chl quelques niveaux, tandis que toutes les autres cultures exposées chl relativement faible a, indépendamment de l'activité enzymatique RubisCO (Fig. 2).

Figure 1.Représentant cultures microbiennes eucaryotes enrichissement qui ont sélectionnés pour la croissance d'organismes différents. Identité de la culture est donnée dans la partie inférieure gauche des panneaux. Toutes les images représentent des micrographies de lumière générées à l'aide immersion dans l'huile à un grossissement de 1000X.

Figure 2. Potentiel capacité de fixation de carbone et de la chlorophylle extractible quelques niveaux dans les cultures microbiennes antarctiques enrichissement eucaryotes isolées du lac Bonney et cultivées sur des milieux de culture différents. Voir le tableau 1 pour plus de détails la culture Encart:. De corrélation de Pearson entre la chlorophylle a le potentiel de fixation de carbone dans l'abondance et les cultures microbiennes antarctiques enrichissement eucaryotes.

Discussion

Les études moléculaires récentes ont rapporté une grande diversité de eucaryotes unicellulaires à travers une gamme d'environnements ^{3, 19, 20;} toutefois, en raison d'un manque d'isolats dans toute la gamme des habitats protistes les rôles fonctionnels de ces espèces individuelles dans les réseaux trophiques sont en grande partie inconnue. Dans cette étude, nous avons décrit des méthodes pour enrichir des espèces microbiennes eucaryotes présentant polyvalence métabolique à partir d'un environn...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BBM	Sigma	B5282
BG11	Sigma	C3061
F / 2	Sigma	G9903
GF / F filtre, 25 mm	Fisher Scientific	09-874-64
GF / F filtre, 47 mm	Fisher Scientific	09-874-71
Polyéthersulfone filtre, 0,45 pores um, 47 mm	Pall Life Sciences	61854
Stérile flacon de culture cellulaire, 25 cm 2	Corning	430639
Diurnachambre de croissance l	VWR	35960-076
Zircon / billes de silice, 0,1 mm diamètre maximal	Produits Biospec	11079101z
Mini-Bead batteur	Produits Biospec	3110BX
Microtube à bouchon à vis (1,5 pi)	USA Scientific	1415-8700
NaH 14 CO 3	Vitrax	VC 194	Gardez en aliquots de 400 ul à -20 ° C
RuBP	Sigma	R0878-100mg	Dissoudre dans 10 mM de Tris-propionique l'acide (pH 6,5)