Caractérisation des mécanismes moléculaires de la<em&gt; In vivo</em&gt; UV induit la cataracte

Konstantin Galichanin; Nooshin Talebizadeh; Per Söderberg

doi:10.3791/4016

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Article de méthode

Caractérisation des mécanismes moléculaires de la

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DOI :

10.3791/4016

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28 novembre 2012

Konstantin Galichanin¹^,² , Nooshin Talebizadeh² , Per Söderberg²

¹St. Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, ²Gullstrand lab, Section for Ophthalmology, Department of Neuroscience, Uppsala University

Dans cet article

Résumé

La cataracte est la principale cause de cécité dans le monde. Rayonnement solaire ultraviolet (UV) est le principal facteur de risque pour le développement de la cataracte. Un modèle animal de loin la cataracte rayons UV-B induite a été développé. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d'enquête de la formation de la cataracte: l'exposition aux rayons UV, RT-PCR quantitative et immunohistochimie.

Résumé

La cataracte est la principale cause de cécité dans le monde ^1. L'Organisation mondiale de la santé définit la cataracte comme une opacification du cristallin de l'œil qui empêche le transfert de la lumière. La cataracte est une maladie multifactorielle associée au diabète, le tabagisme, le rayonnement ultraviolet (UV), l'alcool, les radiations ionisantes, les stéroïdes et l'hypertension. Il existe des preuves expérimentales ^2-4 et épidémiologique ^5,6 que le rayonnement UV provoque la cataracte. Nous avons développé un modèle animal pour les rayons UV B de la cataracte induite dans les deux ⁷ anesthésiés et non anesthésiés animaux ^8.

Le seul remède est la chirurgie de la cataracte, mais ce traitement n'est pas accessible à tous. Il a été estimé qu'un délai d'apparition de la cataracte pendant 10 ans pourrait réduire le besoin de chirurgie de la cataracte de 50% ^9. Pour retarder l'incidence de la cataracte, il est nécessaire de comprendre les mécanismes de formation de la cataracte et de trouver stratégie de prévention efficacegies. Parmi les mécanismes de développement de la cataracte, l'apoptose joue un rôle crucial dans l'initiation de la cataracte chez les humains et les animaux ^10. Notre objectif a récemment été l'apoptose dans l'objectif comme le mécanisme de développement de la cataracte ^8,11,12. Il est prévu qu'une meilleure compréhension de l'effet des rayons UV sur la voie de l'apoptose offrira des possibilités pour la découverte de nouveaux médicaments pour prévenir la cataracte.

Dans cet article, nous décrivons comment la cataracte peut être induite expérimentalement par l'exposition in vivo au rayonnement UV-B. En outre RT-PCR et immunohistochimie sont présentés comme des outils pour étudier les mécanismes moléculaires des rayons UV-B induite par la cataracte.

Protocole

1. L'exposition au rayonnement ultraviolet

15 min avant l'exposition, anesthésier une femelle rat Sprague-Dawley avec un mélange de 90 mg / kg Ketalar (kétamine) et 10 mg / kg Rompun (xylazine) par injection intrapéritonéale.
Placez l'animal dans un dispositif de contention rat et serrer les courroies jusqu'à l'immobilisation du rat sans provoquer un resserrement du tronc ^13.
Instiller Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, dans les deux yeux du rat pour induire une mydriase.
Placez l'animal de sorte que l'œil on est placé contre un faisceau étroit de rayons UV à 300 nm ¹⁴ avec une largeur de 10 nm à mi-hauteur et protéger l'oeil controlatéral avec un ruban noir.
Exposer le rat unilatéralement de sous-seuil de dose 1 kJ / m ² rayons UV-B à 300 nm pour 15 min ^15.

2. Dissection

Après prédéterminé intervalle post-exposition (1, 5, 24 et 120 h), sacrifiez le rat âgé de six semaines (poids <200 g) par carboasphyxie au dioxyde de n et la dislocation des vertèbres cervicales.
Énucléer les yeux. Par la suite, mettre la cornée de l'oeil vers le bas, jusqu'à la face postérieure. Ensuite, faites un trou minimum en appliquant une canule de calibre 27 et pousser tangentiellement à la sclérotique pour éviter d'endommager la lentille qui est très proche de la sclérotique. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pour couper la chirurgie ophtalmique circonférence juste derrière le limbe jusqu'à ce que la partie postérieure de la sclérotique peut être enlevé. Ensuite, soulevez la lentille avec un forceps émoussé courbes.
Enlever les restes du corps ciliaire de l'équateur au microscope optique, en maintenant la lentille dans une solution saline équilibrée de pas plus de 5-10 min.

3. RT-PCR quantitative

Placez une lentille dans un mélange de 350 pi de tampon de lyse RA1 (NucleoSpin RNA II ARN total kit d'isolement) et 3,5 ul β-mercaptoéthanol dans un tube Eppendorf de 2 ml.
Maintenir l'objectif dans ce mélange pendant 30 min à température ambiante.
Homogénéiser l'objectif avecune aiguille jusqu'à ce que le noyau dur de la lentille est à gauche de la lentille (cortex et la capsule de la lentille sont lysées dans le tampon de lyse). Retirer le noyau du mixage.
Conserver les échantillons immédiatement à -70 ° C.
Décongeler les échantillons et de suivre le protocole de "purification d'ARN total à partir de cellules cultivées et des tissus" (NucleoSpin RNA II ARN total kit d'isolement).
Boutique échantillons d'ARN à -70 ° C.
Pour vérifier élimination suffisante de l'ADN de chaque échantillon, exécutez une PCR dans les conditions suivantes (étape 1: 95 ° C pendant 2 min; étape 2 pour 40 cycles: 95 ° C pendant 20 sec, 55 ° C pendant 20 sec, 72 ° C pendant 20 s; étape 3: 72 ° C pendant 7 min) avec des amorces d'ADN spécifiques de p53, de l'avant-5'ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'et 5'-inverse TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' et la Taq ADN polymérase (dNTPack), en fonction de la fabrication protocole. Le produit attendu PCR est de 243 paires de bases.
Exécuter une électrophorèse sur gel d'agarose 1,5% pour détecter l'ADN produit de PCR spécifique de 243 paires de bases. Pour préparer1,5% gel d'agarose dans du tampon TBE prendre 3,75 g d'agarose et de le résoudre dans 250 ml de tampon TBE. Ajouter au bromure d'éthidium (0,5 mg / ml) 500 pl dans 500 ml de solution de gel d'agarose 1,5%. Chauffer le mélange dans un four à micro-ondes et remuer pour résoudre le agarose.

Aucun des échantillons n'a révélé aucun d'ADN spécifiques des produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 1,5%.

Mesurer la concentration des échantillons d'ARN (1 pi) et le rapport de l'absorbance à 260 nm échantillon (ARN) et 280 nm (protéines) dans un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre. Si l'ARN rapport aux protéines du absorbance de l'échantillon d'ARN est de 2,0 ou plus, l'échantillon d'ARN est pur. Si le rapport d'absorbance de l'échantillon d'ARN est inférieur à 2,0, 3,5 refaire ARN étape de purification.
Prenez un volume d'échantillon d'ARN correspondant à 1 ug et de synthétiser l'ADNc suivant le protocole 1 Kit Strand ^er synthèse de l'ADNc (1 ^er volet de synthèse d'ADNc pour kit RT-PCR).
Conserver les échantillons d'ADNc à -20 ° C(Pour une période de 1 ans voire plus, conserver à -70 ° C).
Exécuter quantitative PCR en temps réel sur iCycler MyiQ Real Color système unique de détection par PCR en temps. Charge en triple sur une plaque de 96 puits avec 1 échantillon d'ADNc ul, TaqMan Gene Expression Master Mix, essai TaqMan Gene Expression de la caspase 3, selon les instructions pour la fabrication. Charge en triple sur une autre plaque de 96 puits avec 1 échantillon d'ADNc ul, TaqMan Gene Expression Master Mix, essai TaqMan Gene Expression de 18 ans, selon les instructions pour fabriquer TaqMan Gene (Protocole de dosage Expression). Diluer en série d'une fraction d'ADNc à partir de trois choisis au hasard non exposés lentilles. Exécuter des dilutions en série avec l'ADNc à partir d'échantillons dans une plaque de 96 puits.
Utilisez la méthode de la courbe standard pour la quantification des résultats. Le nombre de cycles de fluorescence de seuil est utilisé en tant que mesure de logiciel MyiQ. Une courbe d'étalonnage exprimant le nombre de cycles au seuil comme fonction de la concentration relative de calibreur est esétabli aux dilutions en série dans chaque plaque. ADNc à partir de trois échantillons non traités lentille a été utilisé pour l'étalonnage. Rapporter le nombre de cycles de seuil pour chaque échantillon à la courbe standard pour obtenir la concentration relative de l'échantillon d'ADNc mesurée. Enfin, obtenir le niveau d'expression des gènes cibles en rapportant la concentration relative de la cible d'ADNc pour les 18 ADNc de contrôle interne.

4. Coloration immunohistochimique

Fixation
1. Disséquer l'œil dans du PBS (Phosphate Buffered Saline, pH 7,4).
2. Mettez l'oeil dans un tube rempli avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans le froid de la glace pendant 20 min. Préparer PFA 4% la veille. Stocker à +4 ° C jusqu'à utilisation. PFA est frais pendant environ une semaine.
3. Retirer PFA avec une micropipette. Ensuite, laver avec du PBS glacé pendant 20 min.
4. Mettez l'œil de saccharose à 30% à +4 ° C pendant la nuit.
5. Mettez l'oeil dans une tasse remplie avec la température de coupe optimale (PTOM) à moyenne (Tissue-Tek). Mettez l'œil dans une position appropriée pour la coupe.
6. Congeler dans OCT-support de la glace sèche.
7. Conserver à -70 ° C jusqu'à utilisation.
Sectionnement
1. Positionnez l'œil pour cryo-coupe dans un plan approprié.
2. Couper trois 5 um d'épaisseur à mi-sagittal articles à partir d'une partie centrale de chaque lentille. Rejeter au moins 6 sections entre les sections successives pour éviter de tacher les mêmes noyaux dans des sections différentes.
3. Une fois qu'un article a été coupé, placez délicatement une lame sur le dessus de celui-ci. La section devrait alors s'en tenir à la diapositive.
4. Laisser les lames sécher à l'air avant de l'utiliser. Les diapositives peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation.
Fluorescence immunohistochimie
1. Laissez échantillons atteindre la température ambiante (5-10 min).
2. Dessinez bords autour des spécimens avec un PAP-stylo (Invitrogen).
3. Laissez la frontière sec pendant un certain temps (10 min).
4. Étiqueter les lames de microscope.
5. Réhydrater dans 1 x PBS pendant 15 min.
6. Perméabiliser en solution standard de bloc de 30 min.
7. Ajouter l'anticorps primaire (anticorps polyclonal de lapin, la caspase-3 clivée anticorps Asp175 9661; Technologie Signalisation cellulaire, Inc) dilué dans une solution de 1:3,000 bloc standard.
8. Conserver dans une chambre humidifiée à +4 ° C pendant la nuit.
9. Laver dans du PBS par pipetage (3 x 5 min) ou par trempage dans un bain de grande taille (> 15 min, 1-2 changements).
10. Ajouter anticorps secondaire (anticorps de lapin anti secondaire avec un spécifique d'absorption / émission de spectre) dilué 1:300 dans la solution de bloc standard.
11. Laver dans du PBS par pipetage (3 x 5 min) ou par trempage dans un bain de grande taille (> 15 min, 1-2 changements).
12. Essuyez PAP-stylo frottis.
13. Stocker dans une chambre humide à température ambiante pendant 3 heures. Éviter l'exposition à la lumière.
14. Ajouter une goutte de Vectashield et placer une lamelle sur la lame. Évitez de faire des bulles.
15. Laisser durcir Vectashield (~ 20 min).
16. Gardez sections in l'obscurité jusqu'à l'analyse.
17. Toutes les sections de commande sont traités en l'absence de l'anticorps primaire.
18. Recherchez les résultats dans quelques heures sous un microscope à fluorescence.
19. Compter les noyaux des cellules épithéliales chez un arceau latéral nucléaire à arc autre côté de chaque lentille nucléaire. Appliquer le filtre bleu standard pour voir tous les noyaux épithéliales du cristallin en bleu et un filtre standard qui correspond à l'émission de l'anticorps secondaire pour voir la caspase-3 noyaux positifs en vert.
20. Notez le nombre de tous les noyaux lentille épithéliale et le nombre de noyaux positifs. Compter les cellules trois fois pour chaque section.