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Les neutrophiles sont le type le plus abondant de globules blancs. Ils constituent une partie essentielle du système immunitaire inné 1. Au cours de l'inflammation aiguë, les neutrophiles sont des cellules inflammatoires premiers à migrer vers le site de la lésion. Le recrutement des neutrophiles à un site de la lésion est un processus par étapes qui comprend d'abord, la dilatation des vaisseaux sanguins pour augmenter le flux sanguin, en deuxième lieu, les changements structurels microvasculaires et d'échapper à des protéines plasmatiques de la circulation sanguine, en troisième lieu, le laminage, l'adhérence et la transmigration des neutrophiles dans l'ensemble du accumulation et quatrième neutrophiles au site de la lésion 2,3; endothélium. Un large éventail de in vivo et in vitro a évolué pour permettre l'étude de ces 4 processus. Cette méthode met l'accent sur la transmigration des neutrophiles à travers les cellules endothéliales humaines.
Une méthode populaire pour l'examen des processus moléculaires impliqués dans la transmigration des neutrophiles utilise humaine neutrophils interagissant avec les cellules humaines primaires endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) 5. L'isolement des neutrophiles a été décrit visuellement ailleurs 6; donc cet article vous montrera la méthode pour l'isolement de cellules HUVEC. Une fois isolées et cultivées à confluence, les cellules endothéliales sont activées aboutissant à la régulation à la hausse des molécules d'adhésion et l'activation. Par exemple, l'activation des cellules endothéliales avec des cytokines telles que le TNF-alpha entraîne la E-sélectine augmenté et IL-8 expression 7. E-sélectine médie de capture et le laminage de neutrophiles et d'IL-8 et d'activation de médiateur d'adhérence ferme de neutrophiles. Après neutrophiles adhérence transmigrer. Transmigration peut se produire paracellularly (à travers les jonctions des cellules endothéliales) ou transcellularly (à travers la cellule endothéliale elle-même). Dans la plupart des cas, ces interactions se produisent dans des conditions d'écoulement trouvés dans le système vasculaire 7,8.
La chambre de plaques parallèles de débit est un système largement utilisé que mile cisaillement hydrodynamique micros contraintes trouvé in vivo et permet l'étude du recrutement des neutrophiles dans des conditions d'écoulement in vitro 9,10. Plusieurs entreprises produisent parallèles chambres d'écoulement de la plaque et ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients. Si fluorescente imagerie est nécessaire, en verre ou en une optiquement similaire polymère doit être utilisé. Les cellules endothéliales ne poussent pas bien sur le verre.
Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour l'imagerie à contraste de phase, DIC et de la transmigration des neutrophiles fluorescente utilisant une lame de faible volume canal ibidi constitué d'un polymère qui prend en charge l'adhérence et la croissance rapides des cellules endothéliales humaines et a des qualités optiques qui sont comparables à verre. Dans cette méthode, les cellules endothéliales ont été cultivées et stimulées dans une μslide ibidi. Les neutrophiles ont été introduits dans des conditions d'écoulement et de la transmigration a été évaluée. L'imagerie de fluorescence des jonctions activé en temps réel de détermination de l'étendue de paracellulaire par rapporttransmigration transcellulaire.