Une plate-forme d'expression pratique et général pour la production de protéines sécrétées à partir de cellules humaines

Résumé

Dans l'ère post-génomique humaine, la disponibilité de protéines recombinantes dans des conformations natives est cruciale pour la recherche structurelle, fonctionnelle et thérapeutique et le développement. Ici, nous décrivons un test et à grande échelle du système expression des protéines dans les cellules embryonnaires humaines de rein 293T qui peuvent être utilisés pour produire une variété de protéines recombinantes.

Résumé

Recombinant expression des protéines dans les bactéries, généralement E. coli, a été la stratégie la plus efficace pour l'expression quantité milligramme de protéines. Cependant, les hôtes procaryotes sont souvent pas aussi appropriée pour l'expression de l'homme, les protéines virales ou eucaryote en raison de la toxicité de la macromolécule étrangère, les différences dans le mécanisme de repliement des protéines, ou en raison de l'absence de modifications co-ou post-traductionnelle particulier chez les bactéries. Des systèmes d'expression basés sur la levure (P. pastoris ou S. cerevisiae) ^1,2, infectées par le baculovirus d'insectes (S. frugiperda ou T. ni) des cellules ³ et acellulaire in vitro des systèmes de traduction ^2,4 ont été utilisés avec succès pour produire des protéines de mammifères. Intuitivement, la meilleure correspondance est d'utiliser un hôte mammifère afin d'assurer la production de protéines recombinantes qui contiennent les bonnes modifications post-traductionnelles. Un certain nombre de lignées cellulaires de mammifères (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, C V-1 des cellules dans O RIGINE portant le S V40 Larget l'antigène T (COS), ovaire de hamster chinois (CHO), et d'autres) ont été utilisées avec succès pour surexprimer milligrammes d'un certain nombre de protéines humaines ^5-9. Toutefois, les avantages de l'utilisation des cellules de mammifères sont souvent contrés par des coûts plus élevés, des exigences de l'équipement de laboratoire spécialisé, les rendements en protéines plus faibles et les temps longs pour développer des lignées stables de cellules d'expression. Accroître le rendement et la production des protéines plus rapide, tout en gardant des coûts bas, sont des facteurs importants pour de nombreux laboratoires universitaires et commerciaux.

Ici, nous décrivons un temps et le coût-efficace, en deux parties la procédure pour l'expression de protéines sécrétées humaines à partir de cellules HEK adhérentes 293T. Ce système est capable de produire microgramme à quelques milligrammes de protéine fonctionnelle pour des études structurales, biophysiques et biochimiques. La première partie, plusieurs constructions du gène d'intérêt sont de produired en parallèle et transfectées de façon transitoire dans des cellules HEK adhérentes 293T à petite échelle. La détection et l'analyse de la protéine recombinante sécrétée dans le milieu de culture cellulaire est réalisée par analyse western blot en utilisant des anticorps dirigés contre disponibles dans le commerce un tag vecteur protéine codée par la purification. Par la suite, des constructions appropriées pour la production de protéines à grande échelle sont transfectées de façon transitoire à l'aide polyéthylèneimine (PEI) dans les usines de cellules 10-couche. Protéines sécrétées dans les volumes litre de milieu conditionné sont concentrées en un montant gérables en utilisant une filtration à flux tangentiel, suivie d'une purification par chromatographie d'affinité anti-HA. L'utilité de cette plate-forme est prouvé par sa capacité à exprimer quelques milligrammes de cytokines, de récepteurs de cytokines, des récepteurs de surface cellulaire, des facteurs de restriction intrinsèques, et des glycoprotéines virales. Cette méthode a également été utilisé avec succès dans la détermination de la structure des trimères ^5,10 glycoprotéine Ebola.

2, est nécessaire. Cette procédure peut être rapidement étendu à des systèmes de plus grande complexité, comme la co-expression de complexes protéiques, des antigènes et des anticorps, la production de virus-like particules pour les vaccins, ou la production d'adénovirus ou des lentivirus pour la transduction de lignées cellulaires difficiles.

Protocole

1. Travail de préparation - Les constructions et les cultures cellulaires

Avant de commencer le protocole, le gène d'intérêt devrait être codon-optimisé pour l'expression dans les cellules de mammifères, et cloné dans un vecteur d'expression approprié en utilisant des techniques de biologie moléculaire. Afin d'assurer le plus de chance pour l'expression réussie, de multiples variantes du gène d'intérêt doit être généré. De nombreux vecteurs d'expression de mammifères sont disponibles dans le commerce et a les étiquettes de purification différents (polyhistidine, l'hémagglutinine, la streptavidine, HALO-Tag, glutathion S-transférase, entre a....

Discussion

Les usines cellulaires 10-couche sont un navire efficace pour la production de quelques milligrammes de protéines. Un avantage majeur de l'utilisation de l'usine cellulaire par rapport aux autres bateaux traditionnels, tels que des bouteilles, flacons roulants secouer ou spinner, c'est qu'ils ne nécessitent pas l'achat de tout équipement de laboratoire supplémentaire. Une norme incubateur à CO ₂ (environ 6,0 pi ³) sera facilement accueillir quatre usines cellulaires 10-couche (Fig........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phosphatase alcaline (BCIP / NBT) solution de substrat liquide	Sigma	B6404
Antibiotiques / antifongique, 100X	Invitrogen	15240062
Anti-HA matrice d'affinité, clone 3F10	Roche	1815016
Anti-HA AcM murin, clone 16B12	Covance	MMS-101P
Flacon de culture cellulaire, culture de tissus T75 cm 2 traité	Corning	430641
Flacon de culture cellulaire, culture de tissus T225 cm 2 traité	Corning	431082
Plaques de culture cellulaire ,6-bien la culture de tissus traités	Corning	3516
Usine cellulaire, 10-couche CellSTACK	Corning	3312
Centramate Omega 5K cassette	Voile	OS005C12
Centramate Omega 30K cassette	Voile	OS030C12
Chromatographie Colonne de verre, cm 1,0.10	Kontes	4204001010
La ciprofloxacine	Sigma	17850
CO 2
Eagle modifié par Dulbecco des médias (DMEM)	Sigma	D5796
Sérum de veau fœtal (FBS), inactivé par la chaleur	Invitrogen	12484-028
Réactif de transfection FuGENE HD	Promega	4709691001
Réactif de transfection GeneJuice	EMD / Merck	70967-6
Glycine	Sigma	G8898
De chèvre anti-IgG de souris F (ab ') 2 piles alcalines	Thermo Scientific	31324
conjugué à la phosphatase anticorps
Hémagglutinine (HA) peptide, de 100 mg	GenScript	de synthèse sur mesure
(Séquence: YPYDVPDYA; une pureté de 95%)
Cellules HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Household blanchiment (4% d'hypochlorite de sodium en poids / volume)	différentes marques sont disponibles
Immobilon-P membrane de PVDF	Millipore	IPVH07850
Kit Miniprep purification de plasmide, Purelink rapide	Invitrogen	K2100-11
Kit Maxiprep purification de plasmide, Purelink HiPure	Invitrogen	K2100-07
NaN 3	Sigma	S8032
Vecteur d'expression pDISPLAY	Invitrogen	V660-20
Pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine), 100X	Invitrogen	15140-122
Tampon phosphate salin (PBS), stérile 1X	Sigma	D8537
Polyéthylèneimine (PEI), linéaires 25 kDa	Polyscience	23966
Poudre de lait écrémé sec	Œillet
Stericup-GP unité du PSE filtration sous vide,	Millipore	SCGPU05RE
0,22 um, capacité de 500 ml
Le bleu trypan	Invitrogen	15250061
Trypsine-EDTA, 0,05% (p / v)	Invitrogen	25300-054
Tween-20	Sigma	P7949
L'acide valproïque	Sigma	P4543
Centramate système à écoulement tangentiel	Voile
CO 2 incubateur humidifié, standard 6.0 cu. pi	différentes marques sont disponibles
Unité d'électrophorèse et le transfert	différentes marques sont disponibles
Incubateur, 37 ° C	différentes marques sont disponibles