Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

1. L'étiquetage des précurseurs neuronaux

Neuroblastes peut être visualisé en utilisant des souris transgéniques qui expriment de manière sélective des protéines fluorescentes en neuroblastes (ie, DCX-GFP, GAD67-GFP), par injection stéréotaxique particules virales codant pour des protéines fluorescentes dans la SVZ ou RMS, ou par greffage de précurseurs neuronales de souris marqueurs (à savoir , DCX-GFP, GAD67-GFP) dans la SVZ de souris de type sauvage. Nous décrivons la procédure de greffage et de l'étiquetage virale des précurseurs neuronaux.

La dissociation des neuroblastes de la SVZ de souris journaliste

1. Les solutions suivantes sont requises pour la dissociation des neuroblastes.

Solution 40X

10 ml Pen / Strept (Stock Pen 10 000 u / ml / Strept 1.000 ug / ml)

10 Glucose ml (Stock 200 mg / ml)

20 ml pyruvate de sodium (100 mM stock)

Préparer des aliquotes de 1 ml

Dissection solution (100 ml)

HBSS 1X - 97,4 ml

HEPES (1 M) - 0,1 ml

Solution 40X - 2,5 ml

DNase solution (20K unités / ml)

DNase I, typeIV de pancréas bovin

150.000 unités dissoudre dans 7,5 ml de H ₂ O

Filtrée de 0,22 um

Préparer des aliquotes de 1 ml

Trypsine DNasel solution (10 ml)

HBSS - 8,6 ml

DNase I (20K unités / ml) - 0,15 ml

Trypsine-EDTA (0,5%) - 1 ml

Solution 40X - 0,25 ml

La trituration solution (50 ml)

BSA (300 mg / ml) - 332,5 pi

Solution 40X - 1,25 ml

DNase I (20K unités / ml) - 0,66 ml

2. Anesthetize deux à trois souris adultes mois, exprimant une protéine fluorescente dans les neuroblastes avec une injection intrapéritonéale de 100 pi de kétamine / xylazine (10 mg / 1 mg par 10 g de poids corporel), puis décapiter. Nous utilisons GAD67-GFP souris ^11. En utilisant le scalpel, couper le cerveau coronaire au niveau du ventricule latéral et disséquer la SVZ en milieu de dissection glacée. Placez la SVZ dans un microtube avec 500 ul de trypsine-DNase solution, et garder sur la glace pendant 20 min.
3. Transférer la SVZ dans un tube conique de 15 ml contenant 5 ml de pré-chauffé (37 ° C) de trypsine-DNase solution et incuber à 37 ° C dans un _5% de CO2 pendant 30 min.
4. Verser le contenu entier dans un tube conique de 50 ml contenant 15 ml de tritsolution guration et centrifuger à 1000 xg pendant 1 min. Aspirer le surnageant, ajouter 10 ml de solution de trituration, de transférer les cellules à un nouveau tube de 15 ml conique, et centrifuger à 1000 xg pendant 1 min.
5. L'incendie polir une pipette Pasteur pour réduire la taille de la pointe et le manteau avec le milieu de trituration. Après la centrifugation, éliminer autant de surnageant que possible, et ajouter 2 ml de solution de trituration frais au tube conique. Triturer les cellules dans la solution de trituration (environ 50 fois de haut en bas avec une pipette Pasteur). Prenez la moitié supérieure du surnageant, qui contient des cellules ainsi dissociées, et de le transférer dans un nouveau tube de 15 ml conique contenant 10 ml de solution trituration.
6. Fire-poli d'une pipette Pasteur pour réduire encore la taille de la pointe. Ajouter un autre 1 ml de solution trituration dans le tube contenant les cellules restantes non dissociées, continuer la trituration (environ 10 fois de haut en bas), et de transférer tout le contenu de la containin 15 ml tube coniqueg de cellules précédemment dissociés. Centrifuger à 1000 xg pendant 7 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ml de milieu neurobasal, charge dans une chambre de comptage, et de compter les cellules.

Greffer le nombre désiré de cellules dans la SVZ utilisant la procédure décrite ci-dessous.

Injection stéréotaxique de greffage et le virus de cellules dissociées

7. Stériliser tous les instruments à l'aide d'un stérilisateur à billes avant de commencer l'opération.
8. Pour les injections stéréotaxiques, utilisez micropipettes de verre avec des pointes très fines (1-2 um) afin de minimiser les lésions cérébrales. Pour faire une pipette, tirer un capillaire en verre avec un extracteur pipette. Le remblai de la pipette avec de l'huile de paraffine jusqu'à ce que à moitié plein, et insérez le piston d'un injecteur nanolitre (World Precision Instruments) dans l'extrémité de la pipette n'est pas traitée.
9. L'utilisation d'un contrôleur nanolitre injecteur, forcer vers le bas d'huile avec le piston jusqu'à ce qu'une petite drop d'huile de paraffine extrude à partir de la pointe fine. Abaissez la pipette dans un récipient stérile avec 0,5 à 1 pi d'une solution contenant soit des particules virales (1x10 ^{6-1x10 8} TU / ml) ou de cellules dissociées SVZ. Utilisez la fonction de retrait de l'injecteur nanolitre pour remplir la pipette avec la solution souhaitée. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air à l'intérieur de la pipette.
10. Anesthetize deux à C57Bl adultes de trois mois vieux / 6 souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine. Utilisez un rasoir électrique pour se raser le site chirurgical sur la tête. Bien nettoyer avec de la gaze humide pour enlever les poils adhérente.
11. Placez la souris sur un cadre stéréotaxique et fixer la tête. Laver le site d'injection sans poils avec du savon désinfectant (Hibitane), puis avec de l'alcool à 70% (gaze ou spray). Désinfecter le site d'Proviodine (gaze ou spray) et couvrent l'animal avec un champ opératoire.
12. Faire une petite incision dans la peau stérilisés de la souris, et bien répartir la peau pour exposerle crâne sous-jacent. Sécher la surface du crâne. Utilisez le bregma et la ligne médiane que les coordonnées du zéro pour définir les antéro-postérieur (AP) et médio-latéral (ML) coordonnées stéréotaxiques, respectivement.
13. Percez un petit trou dans le crâne au-dessus de chaque hémisphère aux coordonnées approprié. Éviter d'endommager le tissu cérébral sous-jacent. Percez soigneusement jusqu'à ce que l'os a été violée. Nettoyer le trou et fixer les coordonnées du zéro pour les dorso-ventral (DV) coordonnées stéréotaxiques sur la surface du cerveau. Nous utilisons la suite de coordonnées (en mm) pour préparations injectables dans la SVZ ou RMS des adultes (22-24 g) C57Bl / 6 souris: pour SVZ: AP 0,70, 1,20 et DV ML 1,90; pour RMS: AP 2,55, 0,82 et ML DV 3,15.
14. Insérez délicatement la pointe de la micropipette de verre dans le cerveau en utilisant les coordonnées appropriées DV comme guides, et injecter lentement une petite quantité (nous injectons 100-500 nl à 5 ​​nl / s) de la suspension cellulaire (dissociée de la SVZ de souris marqueurs) ou d'un solution contenant les particules virales. Nous utilisons habituellementlentiviral ou rétrovirale particules 1x10 1x10 ^{8 6-TU} / ml.
15. Retirer lentement la micropipette de verre, suturer la peau sur le crâne, et placez la souris sur un coussin chauffant pour une récupération plus rapide. Lorsque la souris se réveille après la chirurgie, administrer un analgésique (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 injection par jour pendant 3 jours post-opératoires).

2. Préparation tranches aiguës

1. Les solutions suivantes sont nécessaires pour préparer les tranches aiguës: a) une artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF) à base de saccharose en solution, ci-après dénommée solution de découpe, où NaCl est remplacé par le saccharose pour amortir augmentation de l'excitabilité neuronale au cours de la procédure de préparation de tranches, et b) ACSF contenant du NaCl, chauffé à 32 ° C dans un bain-marie, dans lequel les tranches sont transférées et maintenue jusqu'à ce que l'imagerie.
2. Les solutions contenir les éléments suivants (en mM): solution de découpe: 210,3 saccharose, 3 KCI, 1,3 _MgCl2 x6H ₂ O, 2 CaCl ₂ 2 O 26 NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 20 glucose; ACSF: 125 NaCl, KCl 3, MgCl ₂ 1,3 x6H ₂ O, CaCl 2 ₂ x2H ₂ O, 26 NaHCO _3, 1,25 NaH ₂ PO _4, 20 glucose. Maintenir les solutions à un pH de 7.3 à 7.4, et continuellement oxygéner par barbotage d'entre eux avec 95% O _2/5% de CO _2.
3. Anesthésier la souris avec une administration intrapéritonéale de kétamine / xylazine. Préparer une solution glacée de coupe avec une apparence gélatineuse utilisant de l'azote liquide. Perfuser la souris intracardiacaly avec cette solution à l'aide d'une seringue de 20 cc.
4. Cette procédure doit être effectuée rapidement, habituellement 1-2 min pour 20 ml de solution. Si les vaisseaux sanguins doivent être étiquetés, au lieu de la perfusion avec la solution de découpe, injecter transcardiacally 200 pi de Dextran Texas Red (10 mg / ml) dans le ventricule gauche du coeur et attendre 2-3 minutes avant de décapiter la souris.
5. Décapiter le mouse, et rapidement plonger la tête dans une solution glacée de coupe. Utilisez les ciseaux pour enlever le cuir chevelu, et couper le crâne de la partie postérieure à l'axe long de la suture antérieure à mi-sagittal du cervelet à l'OB. Retirez doucement les volets du crâne à l'aide de pinces.
6. Exciser la partie caudale du cerveau à l'aide d'un scalpel. Couper le cerveau le long de la fissure intrahemispheric, et faire deux coupes sagittales sur la partie la plus latérale de chaque hémisphère (figure 1A). Retirez délicatement le cerveau à l'aide d'une spatule, et le placer dans une solution de coupe glacée.
7. Placer les deux hémisphères séparément sur un bloc de gélose 4% avec la face dorsale de toucher la gélose, et colle le bloc avec les deux hémisphères de la plate-forme d'un vibratome. Collez le côté coupé vers le latéral de l'hémisphère à la plate-forme, en gardant côté médial vers le haut (figure 1B). Placez la plate-forme dans la chambre de la vibratome et le remplir avec solution de découpe. Conserver la solution oxygénée dans le slipréparation ce par barbotage avec 95% ₂ O / 5% de CO _2.
8. Préparer 250 um d'épaisseur sections en utilisant le vibratome. Nous utilisons un Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) et couper les tranches à une fréquence de 100 Hz et une vitesse de 1 mm / sec. Une vitesse de coupe basse et haute fréquence de vibration lame doit être utilisé pour obtenir des articles de grande qualité. Dès qu'une tranche est libérée de la lame, retirez-le délicatement de la solution de coupe et le placer dans une chambre d'incubation rempli ACSF oxygénée maintenue à 32 ° C dans un bain d'eau (figure 1C).

Cette procédure doit être effectuée le plus rapidement possible pour s'assurer que les tranches de meilleure qualité.

3. Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes

L'imagerie des neuroblastes en migration doit être effectuée dans les 6-8 heures de la préparation de tranches et de 3-10 jours après le marquage neuroblastes. Pour éviter les changements de paramètres de migrationen raison de l'injection stéréotaxique qui pourraient induire des lésions cérébrales gliales et d'activation des microélectrodes de verre mince utilisation pointes (1-2 um) afin de minimiser les dommages au cerveau, et de réaliser l'imagerie dans les régions distales du site d'injection (image c'est à dire dans ce qui suit RMS injection dans la SVZ ou dans le bulbe olfactif du RMS suite à l'injection dans le RMS). Bien que l'imagerie peut être effectuée jusqu'à 21 jours après l'injection de particules lentivirales dans la SVZ, nous vous recommandons court intervalle post-injection (3-10 jours), car il permet de visualiser et de suivre plus de cellules par champ de vue.

On utilise un grand champ fluorescent motorisé BX61WI microscope (Olympus) équipé d'une caméra CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) et un objectif à immersion d'eau 40X avec une ouverture numérique 0,8 (Olympus). Les objectifs à plus forte NA fournira une meilleure résolution des images. Neuroblastes marqués (soit greffé à partir d'une souris donneuse journaliste ou un virus étiquetés) ont été ravisavec un Lambda DG-4 équipé d'une lampe au xénon de 175 W (Sutter Instruments) pour 30-100 msec par acquisition z. Multi-longueur d'onde d'imagerie peut également être effectuée à l'aide filtres appropriés (Chroma) pour suivre la migration des neurones le long des autres éléments cellulaires du RMS, telles que les astrocytes marqués par fluorescence ou des vaisseaux sanguins. Le microscope, une caméra CCD et de la DG-4 ont été contrôlés par le logiciel MetaMorph (Device moléculaire) qui a permis aux différents paramètres du programme d'acquisition de time-lapse à régler (voir ci-dessous). Les tranches ont été transférés à un PH1 série 20 chambre ultra-silencieux d'imagerie (Harvard Apparatus) construit sur le microscope. La chambre était reliée à un système de chauffage automatique (TC-344B, Harvard Apparatus) et a été perfusée en continu avec oxygéné ACSF (figure 1D). La température dans la chambre a été maintenue à 31-33 ° C, et la vitesse d'écoulement de l'ACSF est 1-2 ml par min.

1. Placez délicatement la tranche dans la chambre d'imagerie du microscope. Àéviter la dérive de la tranche au cours de l'imagerie, de le stabiliser par précaution de placer un filet en nylon (Warner Instruments) au-dessus de la tranche. La maille est de 0,12 mm d'épaisseur et l'intervalle des ouvertures de 0,3 à 1,13 mm. Positionner le treillis de manière à ne pas obstruer le champ de formation d'image (figure 1D). Utilisez un objectif 10X pour trouver un domaine d'intérêt, puis engager l'objectif 40X et la mise au point.
2. Assurez-vous que la tranche est perfusée en continu avec ACSF et qu'il ya suffisamment de solution entre l'objectif et la tranche. Les variations du taux de perfusion ACSF, la perfusion irrégulière, ou des variations brusques de température provoque la dérive et des changements dans le plan focal lors de l'imagerie.
3. Régler les paramètres d'acquisition à intervalles de temps (durée de l'excitation, le nombre de plans z, la distance entre chaque profilé en Z, l'intervalle de temps, et la durée de l'enregistrement) en utilisant le logiciel MetaMorph, qui commande le système d'acquisition et de démarrer le temps caduque acquisition. Data est automatiquement enregistrée par MetaMorph en tant que fichiers TIFF avec chaque fichier correspondant à un point dans le temps de l'acquisition de time-lapse vidéo.
4. Effectuez l'imagerie pendant au moins 1-2 heures et de prendre en considération les phases migratoires qui sont interrompus par deux phases stationnaires. L'imagerie peut être effectuée pour un maximum de 4 heures (nous n'avons pas effectuer des séances d'imagerie durant plus de 4 heures) sans aucune modification dans les propriétés de migration des neuroblastes. Ne pas les cellules d'image à la surface de la tranche. On habituellement d'image à une profondeur de 20 à 100 um. Nous vous recommandons d'utiliser des intervalles d'acquisition courts (15 - 30 sec) pour déterminer de façon fiable le début et la fin de l'arrêt et des phases de migration.
5. Pour évaluer l'implication de certains facteurs moléculaires de la migration des précurseurs neuronaux, ACSF normale peut être substitué par ACSF contenant aucun agent pharmacologique désiré (c.-à différents agonistes, antagonistes, inhibiteurs, facteurs de croissance, etc.) Effectuer une imagerie pour au moins1 h dans un état de commande, puis pendant 1 heure en présence de l'agent pharmacologique.

4. L'analyse de la migration des neuroblastes

Nous utilisons un logiciel Imaris (Bitplane) pour analyser les données. Cela nous permet de suivre automatiquement la migration des cellules du nouveau-né en 3D. Le forfait comprend le Imaris 7.0F1 MeasurementsPro, Imaris suivi, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer et modules Inpress.

1. Pour ouvrir le film dans Imaris, charger les images acquises (tiff) par simple glisser-déposer l'image du premier point de temps de la vidéo sur l'icône du programme.
2. Une fois que le film est chargé, réglez la luminosité et le contraste du signal dans la fenêtre de réglage d'affichage et définissez les paramètres de la vidéo acquise (taille de voxel et l'intervalle de temps) dans les Propriétés de l'image Régler et équidistants des points les fenêtres de temps (figure 4A) . Après avoir spécifié la taille de voxel, il est possible de voir l'image en 3D ainsi que le temps et l'ampleur de lavidéo.
3. Pour suivre automatiquement les cellules enregistrées, créer une place pour chaque cellule dans le champ de la fenêtre Surpass en choisissant la fonction Spots. Suivez les étapes et définissez les paramètres basés sur les objets imagés (figure 4B). L'un des paramètres est le diamètre de la cellule qui peuvent être mesurés dans la fenêtre de tranche.
4. Inspectez la fiabilité des objets détectés au cours du temps. Si toutes les cellules migrantes ne sont pas automatiquement détecté, changer le seuil de détection (figure 4B), et assurez-vous que toutes les cellules ont été sélectionnés avec des taches à tous les temps.
5. Pendant l'alignement automatique, si deux objets voisins du temps-points ont tout chevauchement entre leurs frontières / bords, une connexion piste sera faite pour chaque recouvrement. La distance maximale et la taille de l'écart maximal (figure 4C) entre deux points représentant les points de temps voisins de la même piste doivent être précisés afin que le programme peut se connecter au poin tempsts. La distance maximale est déterminée par la distance entre l'objet même à la suite des points de temps.
6. Une fois les pistes sont faites, il est possible de filtrer les pistes et supprimer des pistes inutiles en supprimant tout simplement entre eux (figure 4C). Les pistes peuvent être corrigés en connectant et déconnectant les différentes pistes et des points de temps différents sur la même piste (4C Figure).
7. Une fois que toutes les corrections ont été faites, prenez un dernier regard sur les pistes et exporter les données (déplacement de cellules par point de temps, longueur de la piste, longueur de déplacement, la durée piste, etc) dans un fichier Excel (figure 4D).

5. Les résultats représentatifs

Nous avons testé et optimisé à grand champ imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes. L'étiquetage virale ou greffage des neuroblastes marqués par fluorescence dans la SVZ a permis l'expression de GFP dans les cellules migrent robuste (Figure 2). Multi-longueur d'onde d'imagerie peut be appliquée à visualiser la migration le long neuroblaste autres éléments cellulaires du RMS comme les vaisseaux sanguins dextrane TexasRed remplis ⁴ (Figure 3 et film 1), les astrocytes marqués par fluorescence par injection stéréotaxique de virus avec un promoteur spécifique de cellules gliales (Figure 2B) ^12, ou plus précisément étiqueté astrocytes chez les animaux transgéniques.

Large domaine de la vidéo-imagerie de la migration des neuroblastes en tranches aiguës révélé le comportement saltatoire de la migration des précurseurs neuronaux constitués de deux phases distinctes: le déplacement du corps des cellules neuronales vers le processus de premier plan séparées par une phase stationnaire (figure 3, films 1 et 2) . Pour identifier de manière fiable la durée des phases stationnaires et migrateurs et d'en déduire d'autres paramètres de migration cellulaires tels que la vitesse de déplacement (calculé que durant les phases de migration), l'imagerie 3D a été réalisée en utilisant un intervalle d'acquisition court (une fois par 15 ou 30 sec). L'identification précise des durées des phases stationnaires et la migration est cruciale pour l'interprétation claire des données. Par exemple, des différences dans la distance de migration au cours d'une période donnée peut être provoquée soit par les variations du taux de la migration ou par des modifications de la durée ou de la périodicité de la migration et de phases stationnaires. Ces différentes possibilités ne peuvent être distinguées à l'aide de longs intervalles d'acquisition.

Imaris logiciel a été utilisé pour analyser la migration des neuroblastes en 3D et pour dériver des paramètres supplémentaires de la migration des cellules telles que la durée et la piste de longueur de piste, ainsi que la longueur de déplacement de piste, qui est un vecteur de déplacement. La rectitude piste peut être également obtenu en divisant la longueur de piste par piste de déplacement de la longueur et il indique la rectitude de la voie de migration neuroblaste individu.

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Figure 1. Représentation schématique de la préparation des tranches aiguës en direct. Une représentation) Schéma d'une caudale, une intrahemispheric et deux coupes sagittales. Représentation schématique B) de placer le cerveau de la souris sur le bloc d'agar et de la plate-forme vibratome. Représentation schématique C) de la chambre d'incubation tranche aiguë. Représentation schématique D) de la chambre d'imagerie repose sur la microscope droit.

Figure 2. L'étiquetage des neuroblastes dans le SGD. A l'image) à faible grossissement montrant l'étiquetage robuste des neuroblastes et des vaisseaux sanguins chez l'adulte RMS. Un rétrovirus codant pour la GFP a été injecté dans la SVZ et cellules exprimant la GFP (vert) ont été détectées dans le SGD après 3 jours (panneau de gauche). Les vaisseaux sanguins ont été marqués par l'injection de dextran TexasRed dans le cœur de la souris (rouge, panneau de droite). L'encart montre une grande magnifiction l'image des vaisseaux sanguins et des neuroblastes virale étiquetés associés aux vaisseaux sanguins. B) L'étiquetage des différents éléments cellulaires chez l'adulte RMS. Neuroblastes ont été marqués par injection mCherry-encodage lentivirus dans la SVZ (rouge), les astrocytes ont été marqués par l'injection d'un lentivirus codant pour la GFP sous le contrôle d'un promoteur GFAP dans le RMS (vert), et les vaisseaux sanguins ont été marqués par l'injection de Dextran CascadeBlue (bleu ) dans le cœur. Représentation schématique C) de l'injection de GAD67-GFP cellules dissociées de la SVZ d'une souris GAD67-GFP dans la SVZ d'un adulte souris de type sauvage. D) transplantées des cellules GFP-GAD67 (vert) détectées dans les 7 jours après la greffe RMS dans la SVZ. Le RMS est immunomarquées avec GFAP (en bleu). E) transplantées des cellules GFP-GAD67 (vert) étaient immunopositif pour Dcx (rouge), mais étaient immunonegative pour la GFAP (en bleu). Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 3. Imagerie time-lapse de neuroblastes. Imagerie time-lapse de neuroblastes (vert) de migration le long des vaisseaux sanguins (rouge). Les flèches indiquent les phases de migration des neuroblastes, et les flèches indiquent les phases stationnaires.

Figure 4. Analyse de la migration des neuroblastes. (AD) Différentes étapes de la migration des neuroblastes analyse. Les cercles rouges indiquent les différentes fonctions mentionnées dans le texte. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Imagerie vidéo 1. Time-lapse de neuroblastes virale étiquetés (vert) migrant le long de dextrane TexasRed vaisseaux sanguins étiquetés (rouge). Clécher ici pour voir la vidéo.

Vidéo 2. Suivi de migration des neuroblastes par le logiciel Imaris. Les points verts indiquent les corps cellulaires et les pistes indiquent la distance de migration. Cliquez ici pour voir la vidéo .

Aucun conflit d'intérêt déclaré.