Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Résumé

Fluorescent In situ (FISH) pour identifier des transcrits d'ARNm dans des cellules individuelles permet l'analyse de l'activité polygénique tel que la transcription simultanée de plus d'un membre de la Var dans Plasmodium falciparum Érythrocytes infectés ¹. La technique est adaptable et peut être utilisé sur différents types de gènes, des cellules et des organismes.

Résumé

L'adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) à l'homme récepteurs endothéliaux au cours des infections de paludisme est médiée par l'expression de PfEMP1 variantes de protéines codées par les gènes var.

Le P. haploïde falciparum génome abrite environ 60 différents gènes var dont une seule a été soupçonnés d'être transcrit par cellule à la fois pendant la phase de l'infection du sang. Comment une telle réglementation mutuellement exclusif de la transcription des gènes var est atteint n'est pas claire, ainsi que l'identification des différents gènes var ou sous-groupes de gènes var associés aux différents récepteurs et les conséquences de la liaison différentielle sur les résultats cliniques de P. infections à P. falciparum. Récemment, le paradigme de la transcription mutuellement exclusive a été mise en doute par des essais de transcription individuelle sur la base de P. identification transcription falciparum chez inf uniqueète cellules érythrocytaires en utilisant l'ARN d'hybridation fluorescente in situ (FISH) de la transcription des gènes var par le parasite dans différents noyaux de P. falciparum IE ^1.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la réalisation de la méthodologie ARN-FISH pour l'analyse de la transcription des gènes var dans un seul noyau de P. falciparum infection des érythrocytes humains. La méthode est basée sur l'utilisation de la digoxigénine marqué à la biotine et des sondes d'ARN antisens en utilisant la TSA plus Fluorescence Palette Système ² (Perkin Elmer), des analyses microscopiques et fraîchement sélectionné P. falciparum IE. Dans le procédé d'hybridation in situ peut être utilisé pour contrôler la transcription et la régulation d'une variété de gènes exprimés au cours des différentes étapes du P. cycle de vie falciparum et est adaptable à d'autres espèces de parasites du paludisme et d'autres organismes et des types cellulaires.

Protocole

1. Génération de fraîchement sélectionnées érythrocytes infectés

Pour ce test, les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant des cultures fraîchement sélectionnés pour l'expression en surface de la protéine PfEMP1. Dans cette expérience particulière du P. 3D7 lignée falciparum a été sélectionné en utilisant des anticorps spécifiques, comme décrit précédemment ^1.

Jour 1

1. Récolte 200 ul de cellules sanguines emballés à partir d'un P. falciparum culture contenant 2-5% IE tardivement par centrifugation à 800 xg pendant 8 min à température ambiante.
2. ....

Résultats

La figure 1 illustre un organigramme des principales étapes et pendant la durée de la méthodologie FISH ARN.

Une série d'images représentatives de bien et mal conservés tachées expériences FISH ARNm en utilisant unique P. falciparum IE sont présentés dans la figure 2. Ce protozoaire intracellulaire a une petite (1-1.5 um de diamètre) dans le noyau qui est coloré en bleu au DAPI. Vingt-quatre heures après l'invasion érythrocytaire de P. f.......

Discussion

Analyse FISH ARN, contrairement aux méthodes telles que Northern blot et RT-PCR, permet la discrimination des transcrits d'ARNm spécifiques au niveau de la cellule unique. Cela permet de faire la distinction entre les cellules transcriptionnellement actifs et inactifs, dans cet exemple, P. falciparum protozoaires parasites à l'intérieur des globules rouges humains. Ces cellules entières observations sont souvent nécessaires et peuvent percer importantes et nouvelles tendances de la transcription ^1........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide acétique	Sigma / Aldrich	338 826-100ml
Albumax médias: solution de RPMI Glutamine 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 Une solution à 5 ml de glutamine
Albumax médias: Gentamicine sulfate Albumax solution	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamycine sulfate 50 ml de solution Albumax
Albumax solution: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g Hypoxanthine
Albumax solution: AlbuMAX II	Jenvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litres du milieu RPMI 1640 Dissoudre avec aimant au max. 50 ° C. Filtrez stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Résine de deionize formamide.
Anti-biotine conjugué à la peroxydase de chèvre pAb	Calbiochem	203206
Anticorps anti-DIG	Novus biologiques	NB100-41330
Anti-fade réactif avec DAPI	Invitrogen	P36931	Les milieux de montage doit durcir pendant 24 heures avant de sceller complètement la diapositive.
Biotine ARN étiquetage Mix	Roche	11685597910
Appareil photo numérique	Numérique Nikon F11 de vue CC
Lamelles de	Menzel-Glaser	631-1570
flacon de culture de 25 cm 2 de surface Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC dans 1000 ml d'eau deinonized. Ajouter un barreau aimanté et remuer pendant 12 h. Autoclave pendant 30 min.
Appareil photo numérique	Numérique Nikon F11 de vue CC
Protéines Dynabeads A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Aimant	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Formamide désionisée: 5 g de résine échangeuse d'ions par 100 ml de formamide. Mélanger 30 min. Filtrer sur papier Whatman.
. Gélatine 0 solution à 75%: gélatine	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots.
. Gélatine 0 solution à 75%: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 gélatine g dans 500 ml de RPMI 1640. La chaleur à 56 ° C pour dissoudre. Stériliser par filtration alors que 56 ° C. Conserver à -20 ° C en aliquots.
Solution Glutamine: L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtre sterilize et stocker à -20 ° C en aliquots.
Solution Glutamine: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L-glutamine dans 500 ml de NaCl 0,9%. Dissoudre, filtrer stériliser et conserver à -20 ° C en aliquots.
Solution d'hybridation: formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, garder congelé à -20 ° C en aliquots 10 ml de formamide désionisée
Solution d'hybridation: Concentré 50x Denhardt	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Solution d'hybridation: Levure tRNARoche blocage réactif	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt 250 ul de 20 mg par ml de levure ARNt
: ADN de sperme de saumon	Fluka / Sigma	31149-106GF	0.4g Roche réactif de blocage 1 ml de 10 mg par ml d'ADN de sperme de saumon (Critique: saumon dénaturent spermDNA à 96 ° C pendant 5 min avant d'ajouter à la solution d'hybridation)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Peut être remplacé par un four d'hybridation et d'hybridation RNase chambres libres rembourrés avec de l'eau DEPC.
Immersion huile transparente aux UV fluorescence gratuit	Sigma	10976-1EA
Microscope confocal immunofluorescence ou	Nikon D-Eclipse TE2000C
Vernis à ongles	Disponible dans n'importe quelle pharmacie
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC désionisée H 2 O			Ajuster le pH à 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldéhyde à 4%	Fluka / Chemika	76240	4 g PFA dans 80 ml de PBS / DEPC. La chaleur à 65 ° C jusqu'à ce que le PFA dissout. Ajouter 20 ml de PBS, laisser la solution refroidir. Ajuster le pH à 7,4. Filtrer. Boutique en aliquotes à -20 ° C.
Paraformaldéhyde à 4% / acide acétique à 5%			950 paraformaldhyde ul + 50 ul d'acide acétique
Pepsine	Sigma / Aldrich	P7000
Conjugué à la peroxydase anti-biotine	Calbiochem	203206
RBC-milieu de lavage: solution de RPMI Glutamine 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 une solution à 5 ml de glutamine
RBC-milieu de lavage: le sulfate de gentamicine	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamycine sulfate
RNase	Sigma / Aldrich		Faire un 10 mg / ml de solution.
RNase tube de 1,5 ml	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Diapositives 11mm 4 puits	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M
SSC 20x: citrate de sodium dihydraté	Sigma / aldrich	W302600	3 M de NaCl (175 g / l) 0,3 M citrate de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajuster à pH 7,0 avec HCl 1M
PESS 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g de NaCl
PESS 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g de NaH 2 PO 4.
PESS 20x: 4 EDTA en poudre			9,4 g d'EDTA en poudre Ajouter de l'eau DEPC, ajuster le pH 7,4. Autofendit pendant 20 min
TNB mémoire tampon: tampon TNT			10 ml du tampon TNT
TNB mémoire tampon: réactif de blocage			0,05 g de réactif de blocage Pour dissoudre le réactif de blocage, chauffer la solution à 60 ° C pendant une heure sous agitation. Conserver à -20 ° C. (Dérivé de l'Perkin Elmer TSA-protocole).
TNT mémoire tampon: Tris / HCl	Sigma	T1503	1M Tris / HCl, pH 8,0
TNT mémoire tampon: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
Tampon TNT: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajuster le pH à 7,5 à la température ambiante. (Dérivé de l'Perkin Elmer TSA-protocole).
TSA, plus Cyanine3 / fluorescéine système	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Lire le protocole de la TSA Plus System Palette de fluorescence avec soin avant de commencer l'expérience.
Tubes 14 ml stérile	Almeco - CM Aps LAB	91016