En électroporations Ovo d'embryons au stade de poulet 10 HH

Résumé

Poussin dans l'électroporation in ovo est une technique qui permet la manipulation génétique de l'embryon aviaire. Les applications courantes de cette technique comprennent l'analyse fonctionnelle des gènes et des éléments activateurs putatifs. Cette vidéo montre l'électroporation du tube neural chez les embryons de poussins HH 10. Technique d'injection et la manipulation correcte d'œuf sont discutées.

Résumé

Grande taille et du développement externe de l'embryon de poulet ont longtemps fait un outil précieux dans l'étude de la biologie du développement. Avec l'avènement des techniques de biologie moléculaire, le poussin est devenu un système utile pour l'étude de la régulation des gènes et leur fonction. Par électroporation constructions d'ADN ou d'ARN dans l'embryon de poulet en développement, les gènes peuvent être exprimés ou renversé afin d'analyser en fonction des gènes in vivo. De même, constructions rapporteurs peuvent être utilisées pour la cartographie de destin ou d'examiner des éléments de gènes putatifs de régulation. Par rapport à des expériences similaires chez la souris, l'électroporation chiches a l'avantage d'être rapide, facile et peu coûteux. Cette vidéo montre d'abord comment faire une fenêtre dans la coquille de manipuler l'embryon. Ensuite, l'embryon est visualisé avec une solution diluée d'encre de Chine injectée ci-dessous l'embryon. Une aiguille de verre et une pipette sont utilisés pour injecter de l'ADN et Fast colorant vert dans le tube neural de développement, puis des électrodes de platine sont placés parallèlement à l'embryon et de courtes impulsions électriques sont administrés avec un générateur d'impulsions. Enfin, l'œuf est scellé avec du ruban adhésif et replacée dans un incubateur pour le développement ultérieur. En outre, la vidéo montre stockage des œufs et à la manipulation et discute les causes possibles de l'électroporation d'embryons suivantes perte.

Protocole

La manipulation des œufs

1. Les oeufs peuvent être conservés à 13 ° C pendant jusqu'à une semaine avant l'incubation sans perte significative de viabilité (un refroidisseur de vin est idéal pour les petits à cet effet).
2. Avant l'incubation, les oeufs permettent de se réchauffer à température ambiante, puis placer dans un incubateur humidifié de poulet mis à 37,8 ° C (100 ° F).
3. En général, nous électroporation d'embryons d'environ 48 heures après le début de l'incubation, lorsque l'embryon a atteint Hamburger et le stade de Hamilton 10.
4. Temps d'incubation peut varier selon Hamburger désiré et le stade....

Discussion

Ce protocole fournit un guide étape par étape à l'électroporation du tube neural d'embryons de poulet HH10. En plus de montrer la technique, des lignes directrices pour le stockage et la manutention des oeufs est également fourni. Cette technique présente un large éventail d'applications pour l'analyse génétique et le coût aise et peu d'expériences qui les rend possible pour de nombreux laboratoires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur pour œufs de poulet			Humidifié, réglé à 37,80°C (100 °F).
Générateur d'impulsions	Genetronics	BTX T820	Générateur d'ondes carrées ou équivalent
Électrodes			Nos électrodes étaient fabriquées à partir de fil de platine de 0,25 mm de diamètre, mesuraient 5 mm de long et étaient espacées de 1 mm
Câbles de connexion
Micromanipulateur
Loupe binoculaire			avec grande distance de travail
Capillaires en verre			et tireur de capillaires ou aiguilles en verre commerciales
Milieu Leibovitz’s L-15
Œufs de poulet			fécondés
Ciseaux courbes
Seringue de 10 ml
Aiguille à large orifice			16-18G
Pipette buccale
Encre de Chine
Seringue à insuline/seringue
ADN plasmidique			≥ 1μg/μl dans du tampon TE stérile ou du PBS 1X contenant 0,05 % de colorant Fast Green