Article de méthode

Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

DOI :

10.3791/409

⸱

1 novembre 2007

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

Dans cet article

Résumé

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Isolement des lymphocytes utilisant le MAC Miltenyi kit est un moyen fiable pour purifier les cellules de l'ensemble des homogénats de tissu lymphoïde. Les cellules purifiées en utilisant le système Miltenyi sont typiquement ≥ 96% pur. Ici, on justifie les mesures prises pour isoler les cellules CD4 + T, l'une des nombreuses trousses offertes par Miltenyi.

Résumé

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Isolement de cellules provenant de la source primaire est une étape nécessaire dans de nombreux protocoles plus complexes. Miltenyi propose des kits d'isoler les cellules de plusieurs organismes, y compris les humains, les primates non humains, le rat et, comme nous le décrivons ici, chez la souris. Séparation magnétique des cellules à base de billes permet soit la sélection positive (ou la déplétion des cellules) ainsi que la sélection négative. Ici, nous démontrons une sélection négative des cellules CD4 avez intacte ou Na + cellules T auxiliaires. En utilisant ce protocole standard, nous purifie généralement les cellules qui sont ≥ 96% de CD4 pur + / CD3 +. Ce protocole est utilisé en conjonction avec le protocole de dissection et de 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques dans des souris publiée dans le numéro 7 de Jupiter, pour la purification des cellules T et d'autres types cellulaires au adoptive transfert à des fins d'imagerie. Bien que nous n'ayons pas démontrer analyse FACS dans cette vidéo de protocole, il est fortement recommandé de vérifier la pureté globale des cellules isolées en utilisant les anticorps appropriés par FACS. En outre, nous démontrons la méthode non-stériles de l'isolement de lymphocytes T. Si les cellules stériles sont nécessaires pour votre particulière de l'utilisateur final demande, être sûr de faire toutes les procédures ont démontré dans la hotte de culture de tissus dans des conditions standard stériles. Merci pour regarder et bonne chance avec vos propres expériences!

Protocole

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S'il vous plaît lire et suivre le protocole inclus dans le kit Miltenyi ou en ligne à http://www.miltenyibiotec.com/ .

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Discussion

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Isolement de cellules provenant de la source primaire est une étape nécessaire dans de nombreux protocoles plus complexes. Miltenyi propose des kits d'isoler les cellules de plusieurs organismes, y compris les humains, les primates non humains, le rat et, comme nous le décrivons ici, chez la souris. Séparation magnétique des cellules à base de billes permet soit la sélection positive (ou la déplétion des cellules) ainsi que la sélection négative. Ici, nous démontrons une sélection négative des cellules CD4 avez intacte ou Na + cellules ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Rebecca Paquett pour la préparation d'un tampon MACS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon MACSRéactifAucunAucunPréparer comme décrit par Miltenyi.
Kit d'isolement de cellules T CD4+ : isolement sans contact RéactifMiltenyi Biotec130-090-860Pour utilisation avec le système Miltenyi.
Solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS)RéactifPour utilisation dans la préparation du tampon MACS.
Plaque de culture Corning de 35 mm non traitée pour culture tissulaireAutreCorning430588Utilisé pour la préparation d'une suspension de cellules uniques.
Filtre cellulaire de 70 microns Outil BD Biosciences352350Utilisé pour la préparation d'une suspension de cellules uniques.
Seringue de 6 mL OutilTyco Healthcare, Covidien8881516051Utilisé pour la préparation d'une suspension de cellules individuelles.
10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)RéactifInvitrogen14200-075Pour utilisation dans la lyse des globules rouges.
Eau stérile Réactif Sigma-AldrichW4502Pour utilisation dans la lyse des globules rouges.

Références

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  1. Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
  2. Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).

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Mots-clés

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