L'abondance des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses en cluster influe fortement sur la force synaptique. Cette méthode permet de quantifier les récepteurs des neurotransmetteurs marquage fluorescent en trois dimensions avec une seule synapse résolution C. elegans, Permettant à des centaines de synapses d'être rapidement caractérisé au sein d'un échantillon unique sans distorsions introduites par z-plan de projection.
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Article de méthode
Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic
Dans cet article
Résumé
Résumé
La force Synapse se réfère à l'amplitude des réponses postsynaptiques à la libération de neurotransmetteurs présynaptiques des événements, et a un impact majeur sur la fonction circuit global de neurones. Synapse force dépend de façon critique sur l'abondance des récepteurs de neurotransmetteurs en cluster sur les sites synaptiques sur la membrane postsynaptique. Les niveaux de récepteurs sont établis développemental, et peut être modifié par le trafic des récepteurs entre les pools de surface localisée, subsynaptic, et intracellulaires, ce qui représente d'importants mécanismes de la plasticité synaptique et la neuromodulation. Des méthodes rigoureuses pour quantifier synapse-localisée abondance des récepteurs de neurotransmetteurs sont indispensables pour étudier le développement et la plasticité synaptique. La microscopie à fluorescence est une approche optimale, car elle préserve l'information spatiale, en distinguant synaptique de la non-synaptiques piscines, et la discrimination entre les populations de récepteurs localisés à différents types de synapses. La génétique organisme modèle Caenorhabditis elegans est particulièrement bien adapté pour ces études en raison de la petite taille et leur relative simplicité de son système nerveux, sa transparence, et la disponibilité de puissantes techniques génétiques, permettant l'examen des synapses indigènes chez les animaux intacts.
Nous présentons ici une méthode pour quantifier marquage fluorescent récepteurs de neurotransmetteurs synaptiques dans C. elegans. Sa principale caractéristique est l'identification automatique et l'analyse des synapses individuelles en trois dimensions dans plusieurs fichiers de sortie d'avion confocaux microscope, la position tabulation, volume, intensité de la fluorescence et de fluorescence totale pour chaque synapse. Cette approche présente deux avantages principaux sur une analyse manuelle de z-plan des projections de données confocale. Tout d'abord, parce que chaque plan de l'ensemble des données est inclus confocale, pas de données sont perdues à z-plan de projection, généralement basées sur les moyennes d'intensité de pixels ou maxima. Deuxièmement, l'identification des synapses est automatisé, mais peut être inspecté par l'expérimétrique comme les produits d'analyse de données, permettant l'extraction rapide et précise des données provenant de grands nombres de synapses. Des centaines de milliers de synapses par l'échantillon peut être facilement obtenue, la production de grands ensembles de données afin de maximiser la puissance statistique. Considérations pour la préparation de C. elegans pour l'analyse et l'exécution de l'imagerie confocale pour minimiser la variabilité entre les animaux au sein des groupes de traitement sont également discutés. Bien que développé pour analyser C. récepteurs post-synaptiques elegans, cette méthode est généralement utile pour tout type de synapse-localisée protéines, ou même, tout signal de fluorescence qui est localisée aux pôles discrets, puncta, ou les organites.
La procédure est réalisée en trois étapes: 1) la préparation d'échantillons, 2) l'imagerie confocale, et analyse d'image 3). Les étapes 1 et 2 sont spécifiques à C. elegans, tandis que l'étape 3 est généralement applicable à tout signal de fluorescence dans ponctuée micrographies confocales.
Protocole
1. Préparation de Worms pour l'imagerie
Ce segment du protocole est basé sur publia C. techniques de culture elegans 1,2, et est présenté dans la figure 1.
- Cultiver des vers sur des plaques de gélose peptone haute NGM (10 cm) ensemencées avec NA22 E. La bactérie E. jusqu'à près de mourir de faim. Si immunocoloration, une plaque sera fiable de produire assez de vers pour 1 personne tache, compte tenu des pertes le long du chemin, et les critères stricts utilisés pour sélectionner des vers pour l'imagerie (voir partie 2).
- Vers la récolte en vers....
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Discussion
La méthode présentée ici est conçu pour extraire quantitatives multi-paramètres de données pour de grandes populations de synapses dans C. elegans, tout en maximisant la cohérence au sein des groupes de traitement. Trois caractéristiques contribuent à ces objectifs. Tout d'abord, immunomarquage est effectué sur les populations de vers synchrones afin de s'assurer que tous les animaux ont le même âge. Cette étape est cruciale, car la régulation du développement des niveaux d'expression peut masquer l.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier A. Benham pour aider à l'élaboration du protocole. Ce travail a été financé par le NIH NS06747 subvention au BAB
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nom du logiciel | Entreprise | Commentaires (optionnel) | |||||||
| Volocity v4.0 ou supérieur | PerkinElmer / Improvision | Vérifiez votre installation locale de base d'imagerie pour l'accès à ce logiciel. Logiciel de démonstration est disponible sur le site Web de PerkinElmer. Cette méthode ne requiert que le module de quantification de Volocity. | |||||||
| Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques. | |||||||||
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| Tableau 1. Solutions. |
Références
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E.
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