L'analyse in vitro de PDZ-dépendants complexes macromoléculaires CFTR de signalisation

Résumé

Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure épithéliale, a été signalé à interagir avec des protéines et de réglementer divers processus cellulaires importants, parmi lesquels les CFTR PDZ motif-médiées par les interactions ont été bien documentés. Ce protocole décrit les méthodes que nous avons développés pour assembler un macromoléculaire CFTR PDZ-dépendante complexe de signalisation In vitro.

Résumé

Kystique régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose (CFTR), un canal chlorure situés principalement au niveau des membranes apicales des cellules épithéliales, joue un rôle crucial dans l'homéostasie du fluide transépithélial ^1-3. CFTR a été impliqué dans deux maladies majeures: la fibrose kystique (CF) ⁴ et la diarrhée sécrétoire ^5. Dans FC, la synthèse ou l'activité fonctionnelle de la protéine CFTR Cl-canal est réduite. Ce trouble affecte environ 1 sur 2500 personnes de race blanche aux États-Unis ^6. Activité de la CFTR excessive a également été impliquée dans des cas de toxine induit une diarrhée sécrétoire (par exemple, par la toxine du choléra et de la chaleur entérotoxine stable de E. coli) qui stimule la production de GMPc AMPc ou dans l'intestin ^7.

Les preuves qui s'accumulent suggèrent l'existence d'interactions physiques et fonctionnelles entre CFTR et un nombre croissant d'autres protéines, y compris les transporteurs, canaux ioniques, récepteurs, les kinases, les phosphatases, de signauxmolécules ING et éléments du cytosquelette, et ces interactions entre la protéine CFTR et de ses protéines de liaison ont été montré à la critique impliquée dans la régulation de CFTR-médiée transport des ions transépithélial in vitro et également in vivo ^8-19. Dans ce protocole, nous nous concentrons uniquement sur les méthodes que l'aide dans l'étude des interactions entre la queue CFTR carboxyle terminal, qui possède un motif liaison aux protéines [dénommé PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], et une un groupe de protéines échafaudage, qui contiennent un module de liaison spécifique dénommé domaines PDZ. Jusqu'à présent, plusieurs différentes protéines d'échafaudage PDZ ont été signalés à se lier à la queue carboxyle terminal de la protéine CFTR avec des affinités différentes, telles que NHERF1, les NHERF2, les PDZK1, les PDZK2, CAL (CFTR associée à un ligand), Shank2, et le GRASP ^20-27. Le motif PDZ dans CFTR qui est reconnu par PDZ protéines d'échafaudage est les quatre derniers acides aminés à l'extrémité C-terminale (c.-à-1477-DTRL-1480 chez l'homme CFTR) ^20. Il est intéressant,CFTR peut se lier plus d'un domaine PDZ des deux NHERFs et PDZK1, quoique avec plus ou moins d'affinités ^22. Cette polyvalence à l'égard de la protéine CFTR contraignant a été démontré que de l'importance fonctionnelle, ce qui suggère que PDZ protéines d'échafaudage peuvent faciliter la formation de complexes de signalisation macromoléculaire CFTR pour la signalisation spécifiques / sélective et efficace dans les cellules ^16-18.

Multiples dosages biochimiques ont été développées pour étudier la protéine CFTR-impliquant les interactions entre protéines, telles que la co-immunoprécipitation, pull-down assay, par paire test de liaison, colorimétrique paires test de liaison, et le dosage assemblage macromoléculaire complexe ^16-19,28,29 . Nous nous concentrons ici sur les procédures détaillées d'assemblage d'une PDZ motif-dépendante CFTR contenant macromoléculaire complexe in vitro, qui est largement utilisé par notre laboratoire pour étudier protéine-protéine ou un domaine à domaine interactions impliquant la protéine CFTR ^16-19,28,29.

Protocole

1. Expression et purification de protéines recombinantes de fusion associés à des bactéries

1. Amplification des régions définies du C-queue (les 50-100 derniers acides aminés contenant des motifs PDZ à extrémité C-terminale) pour CFTR, APL _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR, et NHERFs (pleine longueur ou PDZ1 ou PDZ2 domaines ) par l'approche de PCR.
2. Cloner les produits de PCR en pGEX4T-1 vecteur de la TPS-protéines de fusion (comme la TPS-NHERFs, TPS-MRP4 CT), pMAL-C2 vecteur de protéines de fusion MBP (comme MBP-β ₂ AR CT, MBP-CFTR CT ), et pour ses pET30-S-protéines de fusion (tel que son-S-CFTR CT, Son-S-PDZK1).

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode in vitro le montage et la détection d'une protéine CFTR contenant un complexe macromoléculaire de signalisation utilisant des protéines purifiées (ou fragments de protéines) et / ou de lysats cellulaires comme indiqué précédemment ^16-19,29,30. Pour obtenir les meilleurs résultats sur les points suivants critiques au cours du processus de préparation nécessitent une attention particulière:

• Il est important que le pH du tampon d'él.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires
pGEX4T-1 vecteur	GE Healthcare	28-9545-49	anciennement Amersham Biosciences
pMAL-C2 vecteur	New England Biolabs
pET30 vecteur	EMD Chemicals	69077-3	anciennement Novagen
Glutathion billes d'agarose	BD Biosciences	554780
Résine d'amylose	New England Biolabs	E8021S
Perles Talon	Clontech	635501
glutathion réduit	BD Biosciences	554782
imidazole	Pêcheur	BP305-50
maltose	Pêcheur	BP684-500
S-protéine d'agarose	EMD Chemicals	69704-3	anciennement Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-IgG CFTR	Fait sur mesure	R1104	mAb reconnaissant CFTR épitope à aa 722-734
Anti-IgG MRP2	Chemicon International	MAB4148	Maintenant une partie de Millipore

Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.