Purification de vacuoles agent pathogène à partir<em&gt; Legionella</em&gt; Infectées par les phagocytes

Résumé

Cet article décrit une méthode pour l'isolement et la purification de intacts Legionella Contenant des vacuoles (VU) de l'amibe et les macrophages. Le protocole en deux étapes comprend l'enrichissement TR par immuno-magnétique séparation utilisant un anticorps dirigé contre un marqueur bactérien TR et la purification en outre par centrifugation en gradient de densité.

Résumé

Le pathogène opportuniste Legionella pneumophila est une bactérie résistante aux amibes, qui reproduit également dans les macrophages alvéolaires causant ainsi la pneumonie sévère "la maladie du légionnaire" ^1. Dans les phagocytes protozoaires et les mammifères, L. pneumophila emploie un mécanisme conservé pour former un particulier, la réplication permissive compartiment, la "Legionella contenant vacuole" (LCV). La formation exige que le LCV bactérienne Icm / Dot système de sécrétion de type IV (T4SS), qui translocation jusqu'à 275 "effecteurs" protéines dans les cellules hôtes. Les effecteurs de manipuler protéines de l'hôte ainsi que des lipides et de communiquer avec sécrétoire, organites endosomes et mitochondrial ^2-4.

La formation de véhicules utilitaires légers représente un processus complexe, robuste et redondant, ce qui est difficile à saisir d'une manière réductionniste. Une approche intégrative est nécessaire pour complètement comprendre la formation des LCV, y compris une analyse globale de la trajectoireles interactions de facteurs fibrinogène-hôtes et de leurs dynamiques temporelles et spatiales. Comme une première étape vers cet objectif, véhicules utilitaires intactes sont purifiés et analysés par la protéomique et la lipidomique.

La composition et la formation de micro-organismes pathogènes contenant des vacuoles a été étudié par analyse protéomique par chromatographie en phase liquide ou 2-D électrophorèse sur gel couplée à la spectrométrie de masse. Vacuoles isolées soit de la discoideum sol social amibe Dictyostelium ou phagocytes de mammifères nourrissait Leishmania ^{5, 6} Listeria, Mycobacterium ^7, Rhodococcus ^{8, 9} ou Salmonella Legionella spp. ^10. Cependant, les protocoles de purification utilisées dans ces études sont longues et fastidieuse, car elles nécessitent par exemple la microscopie électronique pour analyser la morphologie des LCV, l'intégrité et la pureté. En outre, ces protocoles ne pas exploiter les caractéristiques spécifiques de la vacuole pathogène pour enenrichissement par.

La méthode présentée ici permet de surmonter ces limitations en utilisant D. discoideum production d'un marqueur fluorescent TR et en ciblant la protéine bactérienne SIDC effecteur, qui sélectivement ancres à la membrane par TR se lier à la phosphatidylinositol-4-phosphate (PtdIns (4) P) ^3,11. VU sont enrichis dans une première étape par immuno-magnétique de séparation en utilisant un anticorps purifié par affinité primaire contre SIDC et un anticorps secondaire couplé à des billes magnétiques, suivie d'une deuxième étape d'une centrifugation en gradient de densité classique Histodenz ^12,13 (fig. 1) .

Une étude du protéome de véhicules utilitaires légers isolés de D. discoideum a révélé plus de 560 protéines de la cellule hôte, y compris les protéines associées à des vésicules phagocytaires, les mitochondries, ER et appareil de Golgi, ainsi que plusieurs GTPases qui n'ont pas été impliqués dans la formation avant le ¹³ LCV. VU enrichi et purifié avec leprotocole décrit ici peut être encore analysés par microscopie (immunofluorescence, microscopie électronique), des méthodes biochimiques (Western blot) et des approches protéomiques ou lipodimique.

Protocole

1. Préparatifs pour l'isolement LCV

1. Streak à Legionella pneumophila produire DsRed-Express ^13,14 à partir de stocks de glycérol sur gélose CYE avec 5 pg / ml de chloramphenicol (Cam) quatre jours avant l'isolement LCV. Incuber les bactéries à 37 ° C.
2. Semences à 1 x 10 ⁷ D. discoideum produire GFP-calnexine ou RAW264.7 macrophages murins dans 75 cm de culture tissulaire ² flacons une infection jour avant. Utilisez 10 ml HL5 moyenne avec 20 pg / ml G418 pour D. discoideum et incuber les amibes à 23 ° C. Pour utiliser les macrophages RAW264.7 10 ml du milieu RPMI 1640 supplémenté av....

Discussion

Contrairement aux méthodes déjà publiées, ce protocole est basé sur deux étapes, d'abord la séparation des véhicules utilitaires par une approche immuno-magnétique, et la seconde, la purification de véhicules utilitaires par centrifugation en gradient de densité. L'isolement LCV peut être facilement suivie par microscopie à fluorescence, soit quand les bactéries marquées par fluorescence et GFP-cellules productrices ou coloration anticorps est utilisé. Le protocole décrit ici est un simple, straight-forward méth.......