Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

Résumé

Isolement de la crête neurale embryonnaire à partir du tube neural facilite l'utilisation de In vitro Méthodes pour étudier la migration, l'auto-renouvellement, et multipotence de la crête neurale.

Résumé

Le feuillet embryonnaire de la crête neurale (CN) est une population progénitrices multipotentes qui provient à la face dorsale du tube neural, subit une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et migre à travers l'embryon, donnant lieu à divers types cellulaires ^1-3. NC a également la capacité unique d'influencer la différenciation et la maturation des organes cibles ^4-6. Lorsque explanté in vitro, les progéniteurs NC subissent une auto-renouvellement, de migrer et se différencier en une variété de types de tissus, y compris les neurones, cellules gliales, les cellules musculaires lisses, des cartilages et des os.

Multipotence NC a été décrite pour la première à partir d'explants du tube neural aviaire ^7-9. Dans l'isolement in vitro de cellules NC facilite l'étude de la dynamique de NC, y compris la prolifération, la migration et multipotence. Des travaux supplémentaires dans les systèmes aviaires et le rat ont démontré que les cellules explantées NC conservent leur potentiel de NC lorsque transplantées dans l'embryon ¹⁰-13. Parce que ces propriétés inhérentes cellulaires sont conservés dans les progéniteurs NC explantés, le dosage du tube neural explant fournit une option intéressante pour l'étude de la NC in vitro.

Pour atteindre une meilleure compréhension de l'mammifères NC, de nombreuses méthodes ont été employées pour isoler les populations NC. NC dérivés progéniteurs peuvent être cultivées à partir de post-migratoires endroits à la fois dans l'embryon et l'adulte pour étudier la dynamique de progéniteurs NC post-migratoires ^11,14-20, mais l'isolement des progéniteurs NC comme ils émigrent à partir du tube neural fournit une conservation optimale de la CN cellule potentiel et des propriétés de migration ^13,21,22. Certains protocoles utilisent la fluorescence tri cellulaire (FACS) pour isoler une population enrichie en progéniteurs NC particuliers ^11,13,14,17. Cependant, quand on commence avec des embryons à un stade précoce, le nombre de cellules adéquates pour les analyses sont difficiles à obtenir avec FACS, ce qui complique l'isolement de début NC populations à partir d'embryons individuels. Ici, nous décrivons une approche qui ne repose pas sur FACS et les résultats dans un environ 96% de la population NC pure, basée sur un journaliste Wnt1-Cre activé lignée ^23.

La méthode présentée ici est une adaptation de protocoles optimisés pour la culture de rat NC ^11,13. Les avantages de ce protocole par rapport aux méthodes précédentes sont que 1) les cellules ne sont pas cultivés sur une couche nourricière, 2) FACS n'est pas nécessaire d'obtenir une population relativement pur NC, 3) prémigratoire cellules NC sont isolés et 4) les résultats sont facilement quantifiés. En outre, ce protocole peut être utilisé pour l'isolement de NC de tout modèle de la souris mutante, ce qui facilite l'étude des caractéristiques NC avec différentes manipulations génétiques. La limitation de cette approche est que le NC est supprimé à partir du contexte de l'embryon, qui est connue pour influencer la survie, la migration et la différenciation de la NC ^2,24-28.

Protocole

1. Plaques Préparation

1. Utiliser une technique stérile à tout moment.
2. Préparer la fibronectine (FN) en diluant 100 uL de plasma humain FN stock dans un volume final de 3,3 ml dans du PBS de Dulbecco (DPBS). La concentration finale est de 30 pg / ml, ce qui peut être conservé à 4 ° C pendant 1 semaine.
3. Recouvrez le fond de chaque puits d'une culture de tissu stérile de quatre plats bien avec une solution FN et laisser reposer pendant 15 minutes. Assurez-vous que la surface est entièrement recouverte. Sensibiliser les médias pendant cette période (étapes 2 et 3).
4. Retirer FN solution et laisser les plaques sécher. Rincer délic....

Discussion

Une attention particulière devrait être accordée à l'étape du développement de l'embryon afin d'assurer le succès de cette approche. Compter somites d'embryons de souris au début est essentiel à la fois pour la phase correspondant embryons à l'intérieur d'une portée et de déterminer les régions correctes de tube neural pour l'isolement. Une variation de un ou deux somites entre les embryons se situe dans une fourchette raisonnable du calendrier de développement, en fonction de la résolution d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM (faible taux de glucose)	Gibco / Invitrogen	11885
Moyen Neurobasal	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
dPBS	Gibco	14190-144
IGF1	BD Biosciences	354037	Entreposer dans 50 pg / ml d'aliquots à -20 ° C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Entreposer dans 25 pg / ml aliquotes à -20 ° C.
La fibronectine	Gibco	33016-015	Stocké dans 1mg/mL aliquots à -20 ° C.
L'acide rétinoïque	Sigma	R2625	Entreposer dans 35 pg / ml après reconstitution aliquotes dans de l'éthanol à -20 ° C.
Le 2-mercaptoéthanol	Sigma	D-5637
N 2 supplément	Gibco	17502-048
B27 supplément	Gibco	17504-044
Filtres Steriflip um 0,22	Millipore	SCGP00525
La pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15140122
0,20 filtres pm	Corning	431219
Seringues (pour la filtration)	BD Biosciences	301604
Quatre plaques à puits	Thermo Fisher Scientific	176740
Collagénase / dispase	Roche	269 ​​638	Activité varie par lot. Entreposer dans 100 mg / ml d'aliquots à -20 ° C.
Aiguilles à insuline (29 ½ Gage)	Becton Dickson	309306
Chambre hypoxie	Billups-Rothenberg
Analyseur d'oxygène	Billups-Rothenberg
Forceps # 5	Outils belle science		Pour enlever l'utérus et la caduque.
Trypsine-EDTA (0,25%)	Gibco	25200