Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Résumé

Un In vitro Modèle pour l'étude génétique de la régénération des axones en utilisant la souris adultes en culture des neurones ganglionnaires dorsales profondes est décrite. Le procédé comprend une étape pour permettre re-suspension/re-plating axone repousse des neurones subissant une manipulation génétique. Cette approche est particulièrement utile en cas de perte de fonction des études de la régénération des axones en utilisant knockdown protéines ARNi basée.

Résumé

Il est bien connu que les neurones matures dans le système nerveux central (SNC) ne peuvent se régénérer leurs axones après des blessures dues à la capacité intrinsèque diminuée pour soutenir la croissance des axones et un environnement hostile dans le ^1,2 matures du SNC. En revanche, les neurones matures dans le système nerveux périphérique (SNP) de régénérer rapidement après les blessures ^3. Adultes dorsales profondes ganglionnaires (DRG) neurones sont bien connus pour régénérer vigoureusement après lésions des nerfs périphériques. Chaque neurone DRG pousse un axone du soma des cellules, qui se divise en deux branches: une branche axonale périphérique innervant cibles périphériques et une branche centrale se prolongeant dans la moelle épinière. Blessures des résultats DRG axones périphériques dans la régénération des axones substantielle, alors que les axones centraux dans la moelle épinière régénérer mal après la blessure. Toutefois, si la lésion périphérique axonale se produit avant la lésion de la moelle épinière (un processus appelé la lésion conditionné), la régénération des axones centraux est greatly améliorée ^4. En outre, les axones des neurones centraux DRG partager le même environnement hostile comme descendant des axones cortico dans la moelle épinière. Ensemble, on fait l'hypothèse que les mécanismes moléculaires contrôlant la régénération des axones des neurones DRG adultes peuvent être exploitées pour améliorer la régénération des axones du SNC. En conséquence, adultes neurones DRG sont maintenant largement utilisé comme un système modèle pour étudier la croissance des axones régénérative ^5-7.

Ici, nous décrivons une méthode d'adultes DRG neurone culture qui peut être utilisé pour l'étude génétique de la régénération des axones in vitro. Dans ce modèle adulte neurones DRG sont génétiquement manipulés par électroporation à médiation transfection du gène ^6,8. Par transfection neurones avec l'ADN plasmidique ou si / shRNA, cette approche permet à la fois à gain et la perte de fonction des expériences pour étudier le rôle de n'importe quel gène d'intérêt dans la croissance axonale des neurones DRG adultes. Lorsque les neurones sont transfectées avec si / shRNA, la protéine endogène ciblée estgénéralement épuisés après 3-4 jours de culture, au cours de laquelle la croissance axonale temps robuste a déjà eu lieu, ce qui rend les études de perte de fonction moins efficace. Pour résoudre ce problème, la méthode décrite ici comprend une étape de remise en suspension et de re-placage après la transfection, les axones qui permet de repousser à partir de neurones dans l'absence de la protéine ciblée. Enfin, nous donnons un exemple d'utilisation de ce modèle in vitro pour étudier le rôle d'une régénération des axones gène associé à, c-Jun, dans la médiation de la croissance des axones des neurones de l'adulte DRG ^9.

Protocole

1. Préparation des lamelles, milieu de culture, et les enzymes de digestion

1. La ronde de 12 mm n ° 1 des lamelles de verre sont utilisés pour la culture neuronale. Les lamelles sont nettoyées avec 10% HCL nuit suivi d'un lavage à ultrasons avec de l'eau distillée et désionisée pour 3 fois (20 min / heure). Les lamelles nettoyés sont stockés dans l'éthanol à 70% pour une utilisation future. Avant chaque expérience, les lamelles sont séchées à l'air et placé dans la plaque de culture.
2. Pour enrober les lamelles séchées, 100 pi de solution de revêtement contenant 100 ug / ml de poly-D-Lysine et 10 pg / ml laminine solution de travail e....

Discussion

Adultes neurones DRG régénérer leurs axones robuste après une lésion nerveuse périphérique in vivo et in vitro, fournissant ainsi un système utile pour étudier la régénération des axones chez les animaux adultes. Dans la culture in vitro de neurones DRG adultes devient une méthode largement utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels les la régénération des axones est réglementée. La procédure in vitro des neurones en culture de souris adultes DRG .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
MEM	Invitrogen	11090-081
Poly-D-Lysine bromhydrate	Sigma-Aldrich	P6407
La laminine	Invitrogen	23017-015
5-fluoro-2-désoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003
Une collagénase	Roche	10103578001
TrypLE express	Invitrogen	12604-013
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	10270-098
La pénicilline-streptomycine (100X)	Invitrogen	15140-122
Glutamax-I (100X)	Invitrogen	35050-038
Verre lamelles (# 1)	Sciences Electron Microscopy	72196-12
24 plaques à puits culture cellulaire	Becton Dickinson	35-3047
PBS 1X	Mediatech	21-040-CV
Stérile, l'eau distillée et déionisée	Mediatech	25-055-CV
Kits Nucleofector et l'électroporation pour les neurones de souris	Lonza	VPG-1001
SUR-TARGETplus siRNA contre c-Jun	Dharmacon	L-043776
Anticorps anti - tubuline βIII (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
ProLong solution Antifade Or de montage	Invitrogen	P36930