Constant procédé d'extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique

Résumé

Ce protocole décrit un procédé d'extrusion pour la préparation des vésicules lipidiques de tailles submicroniques avec un haut degré d'homogénéité. Cette méthode utilise un système de pression contrôlée avec contrôle des débits d'azote pour la préparation des liposomes. La préparation lipidique ^1,2, L'extrusion des liposomes, et caractérisation de la taille sera présenté ici.

Résumé

Les liposomes sont des vésicules préparées artificiellement constitués de phospholipides naturels et synthétiques qui sont largement utilisés comme une plate-forme de la membrane cellulaire mimant d'étudier protéine-protéine et protéine-lipide interactions ^3, l'administration de médicaments moniteur ^4,5, et l'encapsulation ^4. Les phospholipides naturellement créer bicouches lipidiques courbes, en se distinguant d'une micelle. ⁶ liposomes sont traditionnellement classés par taille et le nombre de bicouches, c'est à dire de grandes vésicules unilamellaires (LUV), de petites vésicules unilamellaires (SUV) et des vésicules multilamellaires (MLV) ^7. En particulier, la préparation des liposomes homogènes de différentes tailles est important pour l'étude de la courbure membranaire qui joue un rôle essentiel dans la signalisation cellulaire, endocytose et exocytose, la fusion membranaire, et ⁸ le trafic de protéines. Plusieurs groupes d'analyser comment les protéines sont utilisés pour moduler les processus qui impliquent courbure de la membrane et donc préparer des liposomes de diamètres <100 - 400nm à étudier leur comportement sur ​​les ³ fonctions cellulaires. D'autres se concentrent sur ​​les liposomes de drogue encapsulation, l'étude des liposomes comme véhicules pour transporter et de livrer une drogue d'intérêts ^9. Encapsulation des drogues peut être réalisé comme indiqué lors de la formation des liposomes ^9. Notre étape d'extrusion ne devrait pas affecter le médicament encapsulé pour deux raisons, à savoir l'encapsulation des médicaments (1) devrait être atteint avant cette étape et (2) des liposomes devraient conserver leur stabilité naturelle biophysique, en toute sécurité de transport de la drogue dans le cœur aqueux. Ces objectifs de recherche suggèrent en outre la nécessité d'une méthode optimisée pour concevoir stables vésicules lipidiques sub-micronique.

Néanmoins, les technologies actuelles de préparation des liposomes (sonication ^10, gel-dégel et ^10, sédimentation) ne permettent pas de préparation de liposomes avec une surface très incurvée (c.-à-diamètre <100 nm) avec une cohérence et une efficacité élevées ^10,5, ce qui limite la biophysique études d'un Emergichamp ng de détection de courbure de membrane. Ici, nous présentons une méthode de préparation robuste pour une variété de liposomes biologiquement pertinentes.

Extrusion manuelle à l'aide de gaz étanches seringues et des membranes en polycarbonate ^10,5 est une pratique courante, mais l'hétérogénéité est souvent observée lors de l'utilisation des tailles de pores inférieur à 100 nm en raison de raison de la variabilité de la pression manuelle appliquée. On a utilisé une installation d'extrusion de pression constante contrôlée de synthèse pour préparer des liposomes dont les diamètres compris entre 30 et 400 nm. Diffusion de la lumière dynamique (DLS) ^{10, 11} et microscopie électronique à l'analyse de suivi de nanoparticules (NTA) ¹² ont été utilisés pour quantifier les tailles des liposomes comme décrit dans notre protocole, avec du polystyrène du commerce (PS) billes utilisées comme étalon. Une corrélation quasi linéaire a été observée entre les tailles des pores travailleurs et les liposomes déterminées expérimentalement, ce qui indique une grande fidélité de notre pression contrôlée préparation de liposomes a rencontréhod. En outre, nous avons montré que cette méthode de préparation lipidique des vésicules est généralement applicable, indépendamment de diverses tailles des liposomes. Enfin, nous avons aussi démontré dans une étude bien sûr du temps que ces liposomes préparés ont été stables pendant jusqu'à 16 heures. Un représentant de taille nanométrique protocole de préparation des liposomes est démontré ci-dessous.

Protocole

1. Préparation de liposomes

1. Récupérer un flacon de 20 ml en verre avec un bouchon de téflon.
2. Nettoyez toute la verrerie et des seringues avec du chloroforme avant de l'utiliser pour prévenir la contamination.
3. Transférer 100 ul de chloroforme de qualité réactif dans le flacon de verre en utilisant une seringue 250 ul de verre étanche à l'air.
4. Ajouter 30 uL de méthanol de qualité réactif dans le flacon de verre en utilisant une même seringue de 100 ul de verre étanche à l'air.
5. Pour préparer un 2 mM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC): phosphatidyléthanolamine (PAPE): solution de lipide de cholestérol, de t....

Discussion

Utilisation de la Avestin LiposoFast LF-50 Extrudeuse, nous avons démontré comment les petites entreprises, les liposomes synthétiques sont préparés grâce à un système commandé par la pression. Il est important de noter que les vésicules multilamellaires se forment spontanément à la suite d'hydratation des liposomes, ce qui peut conduire à la production de petites nanoparticules. Ces petites vésicules multilamellaires inévitablement couler à travers la plus grande taille en polycarbonate pores de la membrane, ce qui.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chloroforme	Sigma-Aldrich	02432-25ML	Stabilisants 95%
Haut de méthanol de qualité	Sigma-Aldrich	179337-4L
LiposoFast LF-50 Extrudeuse	Avestin, Inc
Les phospholipides	Avanti Polar Lipids
Pores en polycarbonate	Avestin, Inc		25 mm de diamètre
Égoutter disques PE	Avestin, Inc	230600	25 mm de diamètre