Un modèle de mortalité faible Rat pour évaluer différée vasospasme cérébral après une hémorragie sous-arachnoïdienne expérimentale

Résumé

Hémorragie sous-arachnoïdienne anévrismale (SAH) est le saignement qui se produit dans l'espace sous-arachnoïdien quand une rupture d'anévrisme. Bien que la morbidité et la mortalité de cet événement a été sur un déclin en raison de l'amélioration des méthodes de traitement, le risque de vasospasme après hémorragie sous-arachnoïdienne continue d'être le même que c'était il ya plusieurs années. L'importance d'établir un modèle animal complet et reproductible pour identifier les événements déclencheurs de vasospasme cérébral a été l'objet de recherches depuis la première utilisation de rats dans un modèle expérimental vasospasme en 1979 par Barry Et al. Les premiers travaux chez le rat ont démontré qu'une seule injection de sang autologue dans la grande citerne conduit à aiguë (quelques minutes) mais non retardé vasospasme cérébral ^{3, 6, 14}. Ici, nous caractériser un modèle faible taux de mortalité chez le rat SAH qui se traduit par un vasospasme retard reproductibles.

Résumé

Objectif: caractériser et mettre en place un modèle reproductible qui démontre retardé vasospasme cérébral après une hémorragie sous-arachnoïdienne anévrismale (SAH) chez le rat, afin d'identifier les événements déclencheurs, les modifications physiopathologiques et des cibles potentielles pour le traitement.

Méthodes: Vingt-huit rats mâles Sprague-Dawley (250 - 300 g) ont été arbitrairement attribué à l'un des deux groupes - SAH ou solution saline de contrôle. Hémorragie sous-arachnoïdienne rat dans le groupe SEP (n = 15) a été induite par double injection de sang autologue, 48 heures d'intervalle, dans la grande citerne. De même, une solution saline normale (n = 13) a été injecté dans la grande citerne du groupe témoin salin. Les rats ont été sacrifiés sur cinq jours après l'injection du sang deuxième et le cerveau ont été conservés pour l'analyse histologique. Le degré de vasospasme a été mesurée à l'aide des sections de tronc basilaire, par mesure de la surface en coupe transversale interne luminale utilisant NIH image-J logiciel. L'importance étaittestée à l'aide de Tukey / Kramer analyse statistique.

Résultats: Après analyse des coupes histologiques, basilaire aire de la section luminale artérielle étaient plus petits dans le SEP que dans le groupe solution saline, compatible avec vasospasme cérébral dans le premier groupe. Dans le groupe SAH, région basilaire carotide interne (0.056 um ± 3) étaient significativement moindre du vasospasme cinq jours après l'injection du sang deuxième (sept jours après l'injection initiale dans le sang), par rapport au groupe témoin salin avec coin interne (0.069 ± 3, p = 0,004). Il n'y avait aucun cas de mortalité du vasospasme cérébral.

Conclusion: Le rat modèle double SAH induit une légère, de survie, vasospasme de l'artère basilaire qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes physiopathologiques de vasospasme cérébral dans un modèle animal de petite taille. Un faible taux de mortalité et acceptable est un critère important qui doit être satisfaite pour un modèle animal idéal SAH afin que les mécanismes de vasospasme peut être ElucidATED ^{7, 8.} D'autres modifications du modèle peuvent être faites pour tenir compte de la gravité accrue des spasmes et des examens neurologiques.

Protocole

1. Chirurgie Rat pour le sujet SAH Injecté Avec 0,15 ml de sang autologue artérielle

1. Le rat est anesthésié avec 0,1 mg / kg de cocktail rongeurs kétamine / xylazine et on laisse reposer pendant 5 min.
2. Une anesthésie adéquate est confirmée par la réduction des réflexes des membres postérieurs.
3. Utiliser un rasoir électronique un col à fouiner domaine de poils autour de la région sous-occipitale est rasée.
4. L'animal est placé en décubitus dorsal sur la table d'opération et la queue est frottée avec de la bétadine pour assurer une incision stérile.
5. A droite de 1 cm incision médiane est prise sur la face ventrale de la queue
6. La dissection est prolongée jusqu'à l'artère caudale est identifiée et isolée.
7. En utilisant une solution stérile de calibre 26 cathéter, l'artère de la queue est canulée et 0,15 ml de sang artériel est prélevée avec une seringue.
8. Une compresse stérile est enroulé autour de l'incision pour assurer l'hémostase avant l'application de la Vetbond pour sceller l'incision.
9. Til rat est mis à plat ventre sur la table et la zone rasée sur la région sous-occipitale est frottée avec de la bétadine.
10. L'utilisation d'un accès incision verticale médiane est acquise à la grande citerne.
11. Une fois identifiée une aiguille de calibre 25 est inséré dans la grande citerne et 0,15 ml de LCR est prélevée avec une seringue pour éviter une augmentation des pressions intracrâniennes avec injection d'un volume de sang autologue.
12. Maintenant, l'0,15 ml de sang extrait de l'artère de la queue est injecté lentement dans la grande citerne.
13. L'aiguille est laissée en place pendant 30 secondes pour assurer la coagulation dans l'espace sous-arachnoïdien et ensuite soigneusement retiré.
14. L'hémostase est assurée et l'incision est refermée à l'aide d'un dispositif d'agrafage.
15. L'animal est alors placé à plat ventre sur une surface de réchauffement avec une tête de 20 ° en position basse pendant 20 minutes pour permettre au sang de se coaguler dans les citernes autour de l'artère basilaire.
16. Étapes de 1,1 à 1,15 sont répétées au cours de la chirurgie 48 h seconde d'intervalle.

2. Chirurgie Rat pour le sujet SAH injecté avec 0,15 ml de solution saline

1. Le rat est anesthésié avec 0,1 mg / kg de cocktail rongeurs kétamine / xylazine et on laisse reposer pendant 5 min.
2. Une anesthésie adéquate est confirmée par la réduction des réflexes des membres postérieurs.
3. Utiliser un rasoir électronique un col à fouiner domaine de poils autour de la région sous-occipitale est rasée.
4. L'animal est placé en décubitus dorsal sur la table d'opération et la queue est frottée avec de la bétadine pour assurer une incision stérile.
5. A droite de 1 cm incision médiane est prise sur la face ventrale de la queue
6. La dissection est prolongée jusqu'à l'artère caudale est identifiée et isolée.
7. En utilisant une solution stérile de calibre 26 cathéter, l'artère de la queue est canulée et 0,15 ml de sang artériel est prélevée avec une seringue.
8. Une compresse stérile est enroulé autour de l'incision pour assurer l'hémostase avant l'application de la Vetbond pour sceller l'incision.
9. Le rat est mis à plat ventre sur la table et la zone rasée sur la région sous-occipitale est peint avec de la bétadine.
10. L'utilisation d'un accès incision verticale médiane est acquise à la grande citerne.
11. Une fois identifié à 25 aiguille de la jauge est insérée dans la grande citerne et 0,15 ml de LCR est prélevée avec une seringue et l'échantillon est conservé.
12. Maintenant, l'0,15 ml de solution saline normale (37 ° C) est injecté lentement dans la grande citerne.
13. L'aiguille est laissée en place pendant 30 secondes et soigneusement retiré.
14. L'hémostase est assurée et l'incision est refermée à l'aide d'un dispositif d'agrafage.
15. L'animal est alors placé à plat ventre sur une surface de réchauffement avec une tête de 20 ° en position basse pendant 20 min.
16. Étapes de 2,1 à 2,15 sont répétées au cours de la chirurgie 48 h seconde d'intervalle.

3. Sacrifice Rat

1. De 5 jours après la deuxième chirurgie, les rats sont sacrifiés par perfusion cardiaque.
2. Le rat est administré une dose mortelle (00,2 ml / kg) de Fatal Plus (VORTECH PHARMACEUTICALS LTD., Dearborn, MI)
3. Avec une incision médiane verticale, la cavité abdominale est approché et le péritoine est ouvert.
4. Une thoracotomie antérieure est effectué et le cœur est exposé.
5. À l'aide d'un cathéter de calibre 26-reliée à une solution tampon phosphate (PBS, pH 7,4 et à 37 °) que l'animal est vidé de son sang et est ensuite perfusé avec du paraformaldéhyde 4%.
6. Après s'être assuré de perfusion adéquate, la perfusion est arrêtée et le rat est présenté à la table décapitation.
7. Après décapitation, une pince-gouge osseuse est utilisé pour retirer le crâne pour l'enlèvement du cerveau.
8. Le cerveau et le tronc cérébral sont soigneusement extraites de la voûte crânienne et placé dans une solution de paraformaldéhyde 4% et conservés à 4 ° C pendant 48 heures.

4. Création de sections pour évaluer vasospasme

1. Le cerveau de rat qui a été immergée dans du saccharose à 30% pendant 4 jours est porté à ecryostat e pour la coupe.
2. Une fois cryoprotégés, 12 uM sections sont créées en utilisant le cryostat, avec l'artère cérébelleuse antérieure inférieure (AICA) comme point de départ afin d'assurer la cohérence inter-sujets.
3. 20 sections sont créées pour chaque animal, se terminant à l'artère cérébelleuse supérieure (SCA).
4. Les sections sont placées sur une lame de verre et évalués pour vasospasme en utilisant une méthodologie histologique

Résultats

Dans les protocoles décrits ci-dessus, il ya plusieurs étapes que nous jugeons nécessaire de mieux caractériser le modèle de ce qui a été décrit précédemment dans la littérature. Ici, nous nous concentrons sur les étapes qui sont essentielles pour parvenir à un faible taux de mortalité cérébrale reproductible modèle animal vasospasme petite et éviter les pièges potentiels associés à ce modèle s'il n'est pas effectué correctement.

1. Tirage de sang autologue à partir de l'artère caud...

Discussion

Primates, ayant une composition plus proche génétique et les caractéristiques anatomiques de l'être humain, imiter de plus près les événements du vasospasme cérébral retardé et peuvent plus facilement l'objet d'imagerie non invasive (IRM et angiographie) pour surveiller les changements artériels, que les rongeurs ^8. Toutefois, les modèles de primates sont un coût prohibitif et associé à des soins plus complexes et les questions éthiques, de petits modèles animaux. Les petits modèles animaux SAH qu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du matériel / des réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Des rats SD mâles (250-300 g)	Taconic	SD-M
26 cathéters G	Webster	8416683
25 Aiguilles G	Buffle	305122
Seringues de 1 cc	Magasins centraux	54245
La kétamine / xylazine cocktail	Protection des animaux (SUNY) *	-
Betadine	Magasins centraux	51458
Saccharose	Sigma	S9378-1kg
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148-500G
Solution de tampon phosphate	Pêcheur	BP-399-4
Table chirurgicale	Harvard	PY2 72-2590
Composé PTOM (cryoprotection)	VWR	25608-930
Diapositives Superfrost	Pêcheur	12-550-15

* Synthétisé au Département de biologie de protection des animaux, SUNY Upstate Medical University. Ajouter 1 cc [100 mg / ml] de xylazine à 10 ml [100 mg / ml] de kétamine.