On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

Résumé

Chambres d'écoulement microfluidiques gravés par photolithographie et fabriqué à partir de PDMS sont appliqués à sonder les résultats fonctionnels associés à une dysfonction CE et de l'inflammation. Dans une expérience représentative, la capacité de contrainte de cisaillement différentiel de moduler l'adhésion cellulaire monocytaire à cytokine activé monocouches CE est démontrée.

Résumé

Athérogénèse est potentialisée par des anomalies métaboliques qui contribuent à un état d'inflammation systémique résultant dans la dysfonction endothéliale. Cependant, les premiers changements fonctionnels dans l'endothélium qui signifient au niveau d'un individu de risque ne sont pas directement évaluée en clinique pour aider à la stratégie de guide thérapeutique. En outre, la régulation de l'inflammation par l'hémodynamique locale contribue à la distribution spatiale non aléatoire de l'athérosclérose, mais les mécanismes sont difficiles à délimiter in vivo. Nous décrivons une approche de laboratoire-sur-une-puce basée sur la perturbation métabolique de déterminer quantitativement les événements inflammatoires dans les cellules endothéliales humaines (CE) et des monocytes dans des conditions d'écoulement précis. Les méthodes standard de lithographie douce sont utilisés pour microfabricate vasculaires mimétiques chambres microfluidiques VMMC), qui sont directement liés à la culture des monocouches de la CE. ¹ Ces dispositifs ont l'avantage d'utiliser de petits volumes de réactifs, tout enfournir une plate-forme pour l'imagerie directement les réactions inflammatoires à la membrane de CE exposé à un champ de cisaillement bien définie. Nous avons appliqué avec succès ces dispositifs pour étudier les cytokines, ^{2 lipidique-3, 4} et ⁵ RAGE-induite dans l'inflammation humaine aortique CE (AHCE). Ici, nous documenter l'utilisation de la VMMC à la cellule de dosage monocytaire (THP-1) de roulement et à l'arrestation sur des monocouches de HAEC qui sont conditionnés selon des caractéristiques de cisaillement différentielles et activé par la cytokine inflammatoire TNF-α. Des études comme celles-ci fournissent une approche mécanistique dans atherosusceptibility sous facteurs de risque métaboliques.

Protocole

1. Culture cellulaire et de préparation des supports

1. Couper 3-pouces substrats circulaires à partir d'un 100 x 20 mm boîte de culture de tissus (BD Falcon) en utilisant un tour. Stériliser substrats par immersion dans l'éthanol à 70%. Placer dans une boîte de Pétri et les enrober de 4 ml collagène de type I (100 pg / ml) pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec 4 ml de PBS 1 x.
2. Suspendre les cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC, le passage 4-6) à 6.5x10 ⁵ cellules / ml et des semences en appliquant 1 ml directement sur ​​le substrat. Placer dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur et permettent aux cellules d'adhérer au substrat pendant 1 heure.
3. Ajouter 9 ml de croissance de l'endothélium moyen-2 (EGM-2) complétée avec 1x antibiotiques antimycosiques solution aux cellules. Changer les médias tous les 2 jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 90% de confluence.
4. Maintenir cellules THP-1 en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS et 1x antibiotiques antimycosiques solution. Au passage des cellules quand elles atteignent une densité de 10 ⁶ cellules / ml.

2. Protocole Shearing portable

Les cellules sont conditionnés dans une mesure cône-plaque de dispositif de cisaillement cellulaire (CDD). Indications sur l'appareil et les spécifications de conception sont documentées dans le tableau 1 et figure 4.

1. Préparer la CDD. Stériliser le boîtier de la chambre avec de l'éthanol et rincer avec du PBS stérile. Chauffer le boîtier à 37 ° C et le niveau de sorte que le cône est perpendiculaire à la monocouche de cellules. Assembler le substrat avec les cellules à partir du fond du boîtier et définir le cône à la hauteur désirée.
2. Utilisation Leibovitz-15 (L-15) un milieu supplémenté avec BulletKit endothéliale que le milieu de cisaillement pour maintenir le pH approprié en l'absence de CO _2. Pour stimuler l'inflammation, ajouter facteur de nécrose tumorale α-(TNF-α, 0,5 ng / ml) dans le milieu de cisaillement et d'injecter 6 ml dans le dispositif par l'intermédiaire d'une seringue reliée à un orifice d'entrée, en prenant soin de ne pas introduire de l'airbulles dans la chambre.
3. Cellules de cisaillement à une contrainte de cisaillement de forte magnitude constante (HSS, 15 dyne / cm ²⁾ ou une contrainte de cisaillement oscillatoire (OSS, 0 ± 5 dynes / cm ^2, 1 Hz) pendant 4 heures. Le SS désiré est obtenu en faisant tourner le cône au-dessus des cellules, qui est contrôlée avec précision avec un moteur micro-pas à pas, comme décrit précédemment ⁶ Le SS mur à la surface (τ _w) est approchée par.:
   
   où μ est la viscosité du milieu, ω est la vitesse angulaire du cône, et α est l'angle de cône (0,5 °). L'alignement du substrat avec une membrane est ajustée à l'intérieur 0,05 ° par nivellement de précision et la hauteur d'écartement fixé à 20 ± 10 um moyen d'une jauge de profondeur pour minimiser la variation circonférentielle et radiale dans τ _w. Le dispositif a été validé pour garantir les caractéristiques d'écoulement laminaire. Retirer caunes de l'appareil et se préparer pour l'analyse de l'adhésion des monocytes.

3. Fabrication de PDMS Microfluidique Chambre

1. Obtenir moule maître pour le numéro de canal désiré microfluidique et la hauteur de canal en fonction de l'application. Les caractéristiques de la conception spécifique utilisé dans ce protocole sont détaillées dans le tableau 1. La méthode pour créer ceux-ci est déjà bien documenté dans la littérature ^1. En bref, le réseau de canaux a été conçu en utilisant le logiciel de CAO (Autodesk Inventor) et imprimé à 5000 dpi sur un transparent. Photorésist négatif (SU8) est filée sur une plaquette de silicium jusqu'à une épaisseur de 100 microns. La transparence est recouverte et exposée à la lumière UV. Non-polymérisé de photorésist est éliminé pour générer le maître réplique positif.
2. Pour faire une solution PDMS mélange à base de silicone avec du silicone agent de durcissement 10:1 en poids dans un bateau peser et mélanger avec une pipette 5 ml sérologique. Veillez à ne pas racler les paroisBateau de la pesée de ne pas ajouter flocons de plastique à la solution.
3. Placer la galette maître dans un plat 100x15mm Petri et versez la solution PDMS dans le plat.
4. Couvrir le plat et le placer dans un récipient vide pendant 15 minutes pour éliminer les bulles. Après 15 minutes de prendre la boîte de Petri et enlever les bulles excès par soufflage d'air doucement sur la surface.
5. Placez la boîte de Petri dans un four pendant 1 heure à 70 ° C. Retirer le plat et découpez les chambres microfluidiques à l'aide d'une lame tranchante.

4. Assemblée des périphériques sur Microscope

1. Tournez sur la source de lumière pour microscope inversé et mis en chauffe à 37 ° C. Fixer le tube à une seringue de 10 ml et remplir d'eau distillée de sorte qu'il n'y ait pas de bulles. Placez la seringue dans le pousse-seringue et le débit ensemble pour induire un SS de paroi de 1 dyne / cm ^2. La contrainte de cisaillement de paroi (τ _w) générés le long de la ligne médiane du canal est approchée en utilisant la normeéquation pour une chambre d'écoulement à plaques parallèles:
   
   où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, et w est la largeur de canal note:. depuis les canaux sont de largeur finie de la réelle τ _w varie avec w en fonction du canal rapport d'aspect, et les mesures sont évités à 25% plus proche des parois latérales. ^1,7
2. Placez PDMS chambre dans l'eau et utiliser une micropipette 100 pi pour éliminer l'air à partir des canaux individuels. Fixer l'adaptateur à vide à la chambre de faire en sorte que la vanne est mise hors service.
3. Placez boîte de Pétri avec monocouche OAB sur l'objectif. Placez la chambre PDMS sur la boîte de Pétri et mettez sur la monocouche OAB, tout en assurant qu'aucune bulle d'air se forment entre l'appareil et la monocouche. Tournez la vanne de sorte que le vide est en marche et la chambre est fermement attaché.
Couper 19 aiguille de calibre émousser telle qu'il n'y a qu'un 5 mm de gauche métallique. Remplissez le réservoir en plastique avec un tampon et de mettre en PDMS chambre d'entrée. Répétez l'opération pour un nombre approprié de canaux qui seront utilisés. Fixer le tube de pompes à seringues pour PDMS exits de canal.

5. Essai d'adhérence des monocytes sous contrainte de cisaillement

1. Suspendre cellules THP-1 à 2x10 ⁶ cellules / ml dans du HBSS + Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} HSA + 0,1%. Activer cellules THP-1 par l'incubation avec le facteur-1 dérivé stromal (SDF-1, 50 pg / ml) pendant 15 min à température ambiante.
2. Activer la pompe à seringue pour établir un flux, puis ajouter 50 ul de la suspension cellulaire au réservoir sans introduire de bulles d'air. Une fois le débit est pleinement développé, commencez d'acquisition de données.
3. Course à 5 min à un débit approprié, ajout d'un tampon dans le réservoir si la solution est faible. Continuer coule dans les canaux mémoire tampon pour laver toutes les cellules non liées dans le flux.

6. Acquisition et analyse des données

1. Acquérir des séquences d'images numériques à 3 images / s pendant 2 min à la suite d'écoulement entièrement développé le long de l'axe longitudinal du canal à 3 endroits dans le canal, en prenant soin de ne pas enregistrer immédiatement après l'entrée ou avant des orifices de sortie ou dans les 25% plus proche du côté murs.
2. Comptez le nombre de cellules arrêtées par champ en identifiant leur phase brillante apparition dans le même plan focal que la monocouche.
3. Arrestation cellule ferme est définie par le mouvement

7. Les résultats représentatifs

Bien que l'endothélium vasculaire est uniformément exposée à des agonistes qui contribuent à l'inflammation systémique, l'athérosclérose est une maladie focale qui se développe préférentiellement sur ​​les sites de perturbation de débit dans les artères, impliquant l'hétérogénéité spatiale de la fonction endothéliale. ⁸ 9, 10 TNF-α induit une réponse bien caractérisé en CE qui inclut la régulation positive de molécules d'adhésion cellulaire (CAM ; par exemple de VCAM-1, ICAM-1, E-sélectine) et des chimiokines qui recrutent les monocytes de la circulation, une caractéristique de la lésion athéroscléreuse début ¹¹ Hémodynamique est un régulateur important de phénotype inflammatoire endothéliale ¹² niveau élevé de stress de cisaillement ampleur (HSS..; p.ex. 15 dynes / cm ²⁾ ou des contraintes de cisaillement pulsatile (PSS; par exemple 15 ± 5 dynes / cm ²⁾ associé à des sites de résistance à l'athérosclérose dans les artères réguler à la baisse du TNF-α-réponses induites. A l'inverse, faible niveau de stress de cisaillement grandeur (LSS; par exemple 2 dynes / cm ²⁾ ou de cisaillement oscillatoire (OSS; par exemple, 0 ± 5 dynes / cm ^2), les caractéristiques des sites sensibles in vivo, exacerbent cytokine l'inflammation induite par. ^{13, 14} microfluidiques Nos appareils PDMS fournir une plateforme pour la réalisation d'études mécanistiques de tester des hypothèses liées à la superposition de stress métabolique avec des facteurs hydrodynamiques dans la régulation de la fonction endothéliale et de la pathologie. L'utilité et la polyvalence de l'approche est largement illustré par les résultats représentatifs suivants.

Figure 1. La contrainte de cisaillement module différentiellement adhérence THP-1 de cellules au TNF-alpha enflammées monocouches endothéliales. Ces données ont été acquises en utilisant le protocole détaillé ci-dessus décrit et documenté dans la vidéo. Monocouches OAB ont été simultanément exposés à une faible dose de la cytokine inflammatoire TNF-α (0,5 ng / ml, ~ CE ₅₀ pour VCAM-1 up-régulation) et soit HSS (15 dynes / cm ²⁾ ou OSS (0 ± 5 dynes / cm ^2, 1 Hz) dans un CDD personnalisé pendant 4 heures comme descrilit dans le protocole détaillé. THP-1 arrestation cellules a été quantifiée dans un écoulement de cisaillement dans une chambre d'écoulement PDMS. Cette lignée cellulaire qui imite le phénotype des monocytes humains a été choisi pour sa reproductibilité et sa facilité d'utilisation. HSS atténué la réponse inflammatoire par rapport à l'OSS, ayant entraîné un arrêt des cellules THP-1 a diminué. Les données ont été analysées par Student-test et sont représentées en moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de DeVerse et al. ⁵

Les données suivantes démontrent la polyvalence de notre approche en utilisant des exemples de notre travail publié. Départs à partir du protocole ci-dessus sont indiquées le cas échéant.

Figure 2. La modulation de cytokine induite par l'expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes dans un gradient de contrainte de cisaillement. A) monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures sous flow dans un VMMC conçue sur la base de la théorie d'écoulement de Hele-Shaw. ¹⁵ A diminution linéaire de grandeur SS le long de la ligne médiane du canal a été obtenue en concevant les parois latérales de la chambre de manière à coïncider avec les lignes de courant d'un flux à deux dimensions et la stagnation de mise en forme l'extrémité du canal pour correspondre aux lignes d'iso-potentiels. La contrainte de cisaillement de paroi (τ _w) générés le long de la ligne centrale de ce canal à une distance axiale de l'entrée (x) est donnée par:

où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, w ₁ est la largeur de canal d'entrée, et L est la longueur totale du canal. Q est choisi pour générer un gradient de grandeur SS de 16 dynes / cm ² à l'entrée à 0 au point de stagnation "a" juste en amont de l'outlet. B) à C) l'expression de VCAM-1 a été mesurée in situ par immunofluorescence en utilisant des anticorps conjugués à des points quantiques et présenté comme intensité de la fluorescence pourcentage médian (MFI) de contrôle statique non stimulé. SS n'a pas de moduler le niveau basal de VCAM-1, qui est faible en non stimulées OAB (triangles gris). Toutefois, l'expression de VCAM-1 a augmenté par rapport au TNF-α à des amplitudes LSS, avec un pic à ~ 2 ^dynes/cm2 et le retour à la ligne de base du TNF-α ou au-dessous des magnitudes de cisaillement> 5 dynes / cm ² (carrés noirs). D) monocytes (10 ⁶ / ml) ont été perfusés à 2 ^dynes/cm2 pendant 5 min dans des canaux d'écoulement parallèles sur des monocouches préconditionnés comme dans A). Le recrutement des monocytes à l'endothélium quantitativement corrélée à la VCAM-1 'expression d'une magnitude contrainte de cisaillement donné. Notamment, la capacité de sonder l'expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes avec une résolution spatiale fine dans un monolayer ont révélé des changements significatifs au cours d'une gamme étroite de grandeur SS qui ne seraient pas appréciés en appliquant seulement quelques valeurs discrètes de cisaillement dans des expériences séparées. Les données ont été analysées par ANOVA mesures répétées et les différences évaluées par post-test de Newman-Keuls, * P <0,05 à partir de TNF-α dans des conditions statiques. Les données sont la moyenne ± SEM de 3-6 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Tsou et al. ²

Figure 3. Lipoprotéines riches en triglycérides (TGRL) moduler l'inflammation induite par les cytokines en proportion à des niveaux de triglycérides sériques et donateurs de VCAM-1 expression. Monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures en même temps que TGRL (10 mg / dl ApoB) isolés à partir des sujets humains après un repas riche en graisses en culture statique. A) l'expression de VCAM-1 a été mesurée séparément dans suspendue CE par cytométrie en fluxet l'adhésion des monocytes quantifiée en utilisant un VMMC tel que décrit dans le protocole détaillé. Les données sont présentées comme variation en% par le TNF-α. Arrestation des monocytes varié en proportion directe de l'endothélium expression de VCAM-1, qui a augmenté directement avec le niveau de triglycérides de sérum de donneur. B) L'arrestation des monocytes pour un sous-ensemble de pro-inflammatoires donneurs a été abrogée en la présence d'un VCAM-1 anticorps bloquant. La signification a été déterminée par jumelé t de Student-test, des moyens ± SEM de 3-5 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Wang et al. ⁴

Discussion

Nous décrivons l'utilisation de dispositifs microfluidiques en PDMS pour l'évaluation sur la puce du phénotype inflammatoire endothéliale par le biais de l'imagerie en temps réel de l'expression CAM et l'adhésion des monocytes. Un avantage majeur de notre approche réside dans la capacité à quantifier les résultats associés à une dysfonction endothéliale dans les cellules exposées à des médiateurs inflammatoires tels que les lipides alimentaires et des cytokines dans des conditions hydrodynamiques définies qui reflètent ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Point	Entreprise	Numéro de catalogue
100 x 20mm boîtes de Pétri	BD Falcon	353003
Éthanol à 95%	EMD Chemicals	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21-031-CV
Collagène de type I Rat Tail dérivé	Gibco	A10483-01
L'homme les cellules endothéliales aortiques	Genlantis	PH30405A
Antibiotiques antimycosique Solution	Invitrogen	15240-062
BulletKit endothéliale	Lonza	CC-4176
Endothéliales basales médias-2	Lonza	CC-3156
10 Seringues ml	BD Falcon	309604
Tubes en polyuréthane	Tygon	ABW0001
Leibovitz-15 avec les médias	Gibco	11415-069
Sylgard 184 base d'élastomère de silicone	Dow Corning	184
Sylgard 184 Durcisseur silicone élastomère	Dow Corning	184
SU8 Wafer Maître Photoresist	UC Davis Pan Lab	N / A
Eclipse TE200 microscope inversé	Nikon	Eclipse TE200
Pousse-seringue	Harvard Apparatus	PHD2000
19 aiguille hypodermique jauge	Kendall	8881
THP-1 lignée de cellules monocytaires	ATCC	TIB-202
HBSS (Hanks solution saline tamponnée) avec le Ca 2 + / Mg 2 +	Gibco	14025-092
Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α)	R & D Systems	210-TA-010
Stromale facteur dérivé - 1 (SDF-1)	R & D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV
Albumine sérique humaine (HSA)	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32