La purification et l'agrégation de la protéine précurseur amyloïde domaine intracellulaire

Résumé

Une méthode pour purification à grande échelle du domaine intracellulaire APP (AICD) est décrite. Nous décrivons également une méthodologie pour induire In vitro AICD l'agrégation et la visualisation par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique / structurelle de l'AICD et les effets de chaperons moléculaires sur son agrégation.

Résumé

La protéine précurseur de l'amyloïde (APP) est une protéine transmembranaire de type I associée à la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer (MA). APP est caractérisé par un grand domaine extracellulaire et un domaine cytoplasmique court appelé le domaine intracellulaire APP (AICD). Au cours de maturation à travers la voie sécrétoire, l'APP peut être clivée par des protéases appelées α, β, γ-sécrétase et ^1. Séquentiel clivage protéolytique de l'APP et de β γ-sécrétase conduit à la production d'un peptide protéolytique petit Aß appelé, qui est amyloïdogénique et le constituant de noyau de plaques séniles. L'AICD est aussi libérée de la membrane après traitement sécrétase, et à travers les interactions avec Fe65 et Tip60, peut translocation vers le noyau de participer à la régulation de la transcription de gènes cibles multiples ^2,3. Interactions protéine-protéine impliquant l'AICD peut affecter le trafic, le traitement et les fonctions cellulaires de holo-APP et son C-termifragments al. Nous avons récemment montré que l'AICD peut agrégat in vitro, et ce processus est inhibé par le ubiquilin-1-AD en cause chaperon moléculaire ^4. Conformément à ces résultats, l'AICD a mis en évidence des domaines hydrophobes et est intrinsèquement désordonnés in vitro ^5,6, mais il obtient une structure secondaire stable lorsqu'elle est liée à Fe65 ^7. Nous avons proposé que ubiquilin-1 empêche inappropriées interactions inter-et intramoléculaire de l'AICD, empêchant l'agrégation in vitro et dans des cellules intactes ^4. Alors que la plupart des études portent sur le rôle de l'APP dans la pathogénie de la MA, le rôle de l'AICD dans ce processus n'est pas clair. Expression de l'AICD a été montré pour induire l'apoptose ^8, pour moduler les voies de signalisation ^9, et de réguler la signalisation calcique ^10. La surexpression de l'AICD et Fe65 dans un modèle de souris transgénique induit la maladie d'Alzheimer, comme la pathologie ^11, et récemment l'AICD a été détecté en soutien-gorgedans les lysats par western blot en utilisant des techniques appropriées de récupération d'antigène ^12. Pour faciliter les études structurales, biochimiques et biophysiques de l'AICD, nous avons développé une procédure pour produire des quantités importantes de protéine recombinante AICD très pur. En outre, nous décrivons une méthode pour induire l'agrégation in vitro thermique de l'AICD et l'analyse par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique, biophysique et structurale de l'AICD et les effets de chaperons moléculaires sur l'agrégation AICD.

Protocole

1. Expression du recombinant domaine intracellulaire APP (AICD)

1. Transform E. coli souche BL21 avec AICD humaine (résidus 649-695 de l'APP, isoforme neuronale de numérotation) cloné dans le vecteur pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Ce vecteur exprimera AICD que le fragment C-terminal d'une protéine de fusion de glutathion-S-transférase (GST). Ce vecteur code également pour une séquence de clivage de la thrombine pour faciliter le retrait du fragment GST. Détails du clonage AICD dans pGEX-4T-1 peuvent être trouvées dans notre publication précédente ^4.
2. D'une seule colonie, inoculer 10 ml de bouillon LB avec ampicilline (100 pg / ml) et incuber une nuit à 37 ° C avec agitation vigoureuse.
3. Le lendemain matin, inoculer 400 ml de LB / ampicilline dans un ballon d'un litre avec 5 ml de la culture d'une nuit.
4. Incuber à 37 ° C avec une agitation vigoureuse jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm a atteint 0,4 à 0,6. Cela prend normalement 2 à 2,5 heures.

contenu "> A ce stade, il peut être souhaitable de prendre un petit échantillon (~ 10 pi) pour suivre la purification par SDS-PAGE (voir la figure 1A, B). Chaque étape ultérieure de purification devrait également avoir une petite aliquote prélevée pour analyse par SDS-PAGE.

5. Induire l'expression de GST-AICD en ajoutant 0,4 mM d'isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Incuber à 37 ° C avec une agitation vigoureuse pendant 5 heures.
6. Centrifuger les cellules à 6000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Le culot cellulaire peut être conservé à -80 ° C pendant plusieurs mois à ce stade de la procédure.

2. Purification de la TPS-AICD

1. Préparer 50 ml de tampon de lyse comme suit: 1 mM de dithiothréitol, 1 mM d'acide éthylène diamine (EDTA), 0,1% de Triton-X100, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), Complete cocktail inhibiteur de la protéase (Roche Applied Science), et un tampon phosphate salin. Refroidir sur glace.
2. Décongeler culot bactérien (s'il a déjà été congelé) surglace.

À ce stade, il est essentiel que toutes les mesures sont réalisées à 4 ° C pour limiter la protéolyse. Tous les tubes, les tampons et autres réactifs doivent être pré-refroidi. Si vous utilisez un presse française ou émulsifiant pour la lyse, ceux-ci doivent être pré-réfrigérés ainsi.

3. Bien remettre en suspension le culot bactérien dans 20 ml de tampon de lyse. Une combinaison de tourbillonnement et trituration avec 10 ml pipette sur glace assurer la remise en suspension complète de la pastille.
4. Passez les cellules remises en suspension bactérienne à travers un émulsifiant (par exemple, Avestin EmulsiFlex-C3) ou de cellules pression française, de pré-réfrigérés à 4 ° C à 30000 psi. Passer le lysat par l'émulsifiant une deuxième fois. Recueillir le lysat dans un pré-réfrigérés tube de 50 ml.

Le principal avantage de ces deux instruments est qu'ils minimiser l'échauffement de l'échantillon. La technique couramment utilisée de sonication produit une chaleur considérable à la pointe de la sonde de sonication etpeut se traduire par l'agrégation de protéines recombinantes.

5. Centrifuger le lysat à 15.000 xg pendant 30 min. Séparez-les et gardez le surnageant dans un pré-réfrigérés tube de 50 ml.
6. Ajouter 500 ul d'une suspension de 50% de la glutathion-agarose (Sigma-Aldrich). Tourner pendant 30 min à 4 ° C. Alors que l'échantillon est en rotation, faire tampon d'élution frais: 50 mM Tris 7,8, 0,1% de Triton-X100, 0,5 mM de dithiothréitol, 10 mM de glutathion réduit.

La seule étape du protocole, qui est exécuté à la température ambiante est l'étape d'élution. Ainsi, le tampon d'élution est maintenue à la température ambiante. Tampon d'élution doit être préparé.

7. Verser la pâte dans lysat et un jetable 5 "colonne de chromatographie en polystyrène avec grossières (de 90 à 130 um) filtres (Evergreen Scientific). Laver la colonne 5 fois avec 3 ml de tampon phosphate salin.
8. Coiffer la partie inférieure de la colonne et ajouter 500 ul de tampon d'élution à température ambiante. Coiffer la partie supérieure de l'et faire tourner la colonne pendant 5 minutes à température ambiante. Recueillir l'éluat dans un tube de 1,5 microcentrifugeuse réfrigérée ml. Répéter l'élution deux fois plus (1,5 ml éluat total).
9. Dialyser l'éluat dans un 10.000 membrane de dialyse poids moléculaire de coupure (par exemple, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer dialyse cassettes) dans 4 litres d'un tampon phosphate salin nuit à 4 ° C. Dialyse contre encore 4 litres de tampon phosphate salin à 4 ° C pendant 1 heure le jour suivant.
10. Éliminer la protéine à partir de la cassette de dialyse et d'effectuer un test de quantification de protéines afin de déterminer le rendement de GST-AICD. Une purification typique de 400 ml de culture se traduira par des rendements de> 20 mg de protéine purifiée à une concentration de 10-20 mg / ml. Aliquoter la protéine dans 200 aliquotes et congeler à -80 ° C.

3. Clivage de la thrombine de la TPS-AICD et purification de l'AICD

1. Dégel 200 pi d'eau purifiée GST-AICD et ajouter 20 ul de 1 U / ul Thrombpo Incuber une nuit à 37 ° C.

La qualité et la pureté de la thrombine varie considérablement selon les fabricants, et peut être une source importante de contamination. Nous utilisons la thrombine de GE Healthcare (voir tableau des réactifs). Après une nuit d'incubation,> 95% de la protéine de fusion devrait être clivé (figure 1B).

2. Après clivage du jour au lendemain avec de la thrombine, il est probable qu'une fraction de l'AICD libéré a subi l'agrégation et la solution peut paraître trouble. Décochez la matière agrégée par centrifugation à 20.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Retirer le surnageant dans un tube de centrifugeuse pré-réfrigérés.
3. Ajouter 50 ul de 50% de glutathion-agarose boue et 50 ul de 50% de p-aminobenzamidine-agarose bouillie pour éliminer la TPS et de la thrombine, respectivement. Incuber avec rotation pendant 5 min à température ambiante.
4. Centrifuger brièvement pour sédimenter les billes d'agarose, et retirer le surnageant dans un nouveau tube. Extrait til TPS quatre fois plus de glutathion-agarose. Une seule extraction avec du p-aminobenzamidine-agarose est suffisante pour éliminer l'U 20 de la thrombine.
5. Effectuer un essai de quantification des protéines sur 5 ul de l'AICD purifié. Les rendements typiques d'une culture de 400 ml sont 50-100 pg à une concentration de 0,2 à 0,5 mg / ml. Des rendements plus élevés sont possibles par clivage de plus grands volumes de TPS-AICD.

Purifiée AICD doit être préparé pour la caractérisation biochimique / biophysique. Le matériau non utilisé doit être jeté. Il est également possible de concentrer l'AICD par lyophilisation de l'échantillon et la remise en suspension dans un plus petit volume de tampon ^6. Si la détection de l'AICD nécessite blot (par exemple après un piège filtre ou un test dot blot), récupération d'antigène sur la membrane doit être effectué comme décrit par Pimplikar et Suryanarayana ^12.

4. Agrégation de l'AICD pour la microscopie à force atomique (AFM)

1. Diluer fraîchement préparé AICD en phosphate une solution saline tamponnée à une concentration de 0,1 mg / ml dans un volume final de 15 ul. À ce stade, divers composés et / ou des protéines peuvent être ajoutés afin de déterminer si elles inhibent l'agrégation AICD. Par exemple, nous avons montré que des concentrations équimolaires de ubiquilin-1 empêcher l'agrégation de l'AICD dans cet essai ^4.

Il est également possible d'agréger des volumes de réaction plus importants pour des expériences biochimiques tels que les essais piège de filtre et diffusion de la lumière ^4. Nous avons eu des succès effectuer des dosages piège de filtre sur les mélanges de réaction plus grande que 400 pi avec AICD dilués à des concentrations aussi faibles que 1 uM.

2. Induire l'agrégation thermique par l'incubation des échantillons à 43 ° C sous agitation à 800 rpm dans un Thermomixer Eppendorf pendant 48 heures. Cette température a été choisie en fonction de chaperon tests qui examinent l'agrégation thermique de la synthase modèle chaperon citrate ^4,13 substrat.

3. Diluer l'échantillon de 20 fois dans de l'eau déminéralisée et place 2 pl sur du mica fraîchement clivé. Sécher l'échantillon dans un dessiccateur durant la nuit. Il sera nécessaire de déterminer empiriquement la dilution optimale pour l'imagerie, et donc plusieurs dilutions allant de 10 - à 100 fois serait prudent.
4. Visualisez l'AICD agrégés en utilisant l'AFM exploitation en mode tapping ^14. Les leviers utilisés sont revêtues d'or micro leviers de nitrure de tranchants (MSNL, Bruker) avec un rayon de pointe nominal de 2 nm. Typique tapant amplitudes au courstion d'imagerie sont 10-20 nm à la fréquence de résonance des leviers (30-50 kHz).

Nous avons constaté que la qualité d'image et de contraste d'agrégats de protéines différentes dépendait de la force appliquée et la durée de l'expérience. Afin de minimiser la perturbation de la pointe d'échantillon, on maintient la force appliquée relativement basse en conservant un rapport de consigne au-dessus de 95% et de limiter le balayage de chaque échantillon de 5-10 min. Traitement de l'image a été réalisée avec le logiciel WSxM (Nanotec). Traitement d'image standard reposait d'avion soustraction et d'aplatissement. Nos laboratoires utilisent une «maison construite" AFM ¹⁵ couplé à un système de balayage de sonde contrôle commercial microscope (Nanotec).

5. Les résultats représentatifs

L'expression et l'enrichissement relatif de la TPS AICD est illustré à la figure 1A. Après la lyse, la majorité de la protéine de fusion est présente dans la fraction soluble, et par conséquent l'extraction de Inclusile corps n'est pas nécessaire. La matière éluée de la colonne d'agarose glutathion est> 95% de pureté. Dans la préparation de la figure 1, la concentration de la protéine éluée de la colonne était de 14,5 mg / ml, et le rendement est de 22 mg (à partir d'une culture de départ de 400 ml). Le clivage de 200 pi de cette préparation pendant la nuit avec 20 U de thrombine donné lieu à près de 100% clivage de la protéine de fusion (figure 1B). La quantité de thrombine utilisée est suffisamment faible pour ne pas être détectable par coloration au bleu de Coomassie (voir «clivée» figure 1B voie,). Suppression de la thrombine et de la TPS a entraîné une certaine perte de matériel, mais il était> 90% pur avec un rendement de cette préparation de 70 ug de l'AICD à une concentration de 0,35 mg / ml. Figure 1C montre le diagramme pour l'agrégation de l'AICD et une analyse ultérieure. Agrégats AICD imagées par AFM sont généralement sphéroïde / amorphe, et varient en taille de 50 à 100 nm (figure 1D, F). Agrégéesmatériau n'est pas détectable lorsqu'une quantité équimolaire du chaperon ubiquilin-1 est ajouté à la réaction de coagulation (figure 1E) ^4.

Figure 1. Purification et l'agrégation de l'AICD. A) au bleu de Coomassie coloration des échantillons prélevés à chaque étape du processus de purification. Pour les échantillons non induits et induits, 20 ul de bactéries totales ont été effectuées sur le gel. Pour la fraction surnageante, 5 pl de lysat (d'un volume total de 20 ml) ont été effectués sur le gel. Pour la fraction de culot, le culot a été remis en suspension dans 20 ml de tampon de lyse, et 5 pi de ce matériel ont été soumis à une sonication dans un sonicateur bain-marie pendant 30 min à 4 ° C avant le chargement sur le gel. Pour le flux continu, 5 ul ont été effectués sur le gel. Les quantités d'éluat chargés sur le gel sont indiqués. B) Gel teinté bleu de Coomassie de non clivée et clivée TPS-AICD (2 pi) et de 1 et 5 m &u; l purifiée AICD. C) Organigramme de purification AICD, l'agrégation et l'analyse. D, E) représentant l'image de l'AFM thermiquement agrégées AICD en l'absence (D) et en présence (E) de la protéine chaperon moléculaire ubiquilin-1. F) Histogramme de la distribution en taille des agrégats AICD.

Discussion

Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure pour l'obtention de l'AICD très pur pour analyses structurales, biophysiques et biochimiques. Cette procédure ne nécessite pas de matériel sophistiqué et chromatographie est donc accessible à la plupart des laboratoires. D'autres groupes ont purifié AICD ^5-7,16, y compris la TPS-AICD ^17-19, pour des analyses biochimiques / structurelle. Inconvénients aux protocoles précédents incluent une mauvaise solubilité de l'AICD ^16,...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
pGEX-4T-1	GE Healthcare	28-9545-49
La thrombine	GE Healthcare	27-0846-01
Ampicilline	Fisher Scientific	BP1760
Réactif de Bradford dosage des protéines	Bio-Rad	500-0002
Bleu de Coomassie	Bio-Rad	161-0786
IPTG (isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside)	Sigma-Aldrich	I6758
Le glutathion-agarose	Sigma-Aldrich	G4510
p-aminobenzamidine-agarose	Sigma-Aldrich	A7155
Complete cocktail inhibiteur de la protéase	Roche	11836170001
Cassettes de dialyse Slide-A-lyseur	Thermo Scientific	66380
Colonnes de chromatographie	Evergreen Scientific	208-3367-050
Émulsifiant	Avestin, Inc	EmulsiFlex-C3	Fortement recommandé
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670107
Disques de mica	Ted Pella	50-12
Cantilevers AFM	Bruker	MSNL-10
WSxM logiciel	Nanotec	N / A	Free téléchargement