L&#39;imagerie non-invasive de rejet aigu après transplantation rénale Rat aide<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Alexander Grabner; Dominik Kentrup; Uta Schnöckel; Gert Gabriëls; Rita Schröter; Hermann Pavenstädt; Otmar Schober; Eberhard Schlatter; Michael Schäfers; Stefan Reuter

doi:10.3791/4240

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

L'imagerie non-invasive de rejet aigu après transplantation rénale Rat aide

16.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/4240

⸱

28 avril 2013

Alexander Grabner^*¹ , Dominik Kentrup^*¹ , Uta Schnöckel² , Gert Gabriëls¹ , Rita Schröter¹ , Hermann Pavenstädt¹ , Otmar Schober² , Eberhard Schlatter¹ , Michael Schäfers^*³ , Stefan Reuter^*¹

¹Department of Internal Medicine D, Experimental Nephrology, University of Münster, ²Department of Nuclear Medicine, University of Münster, ³European Institute for Molecular Imaging, University of Münster

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un modèle de transplantation rénale chez le rat afin d'évaluer de façon non invasive rejet aigu d'allogreffe utilisant la tomographie par émission de positons au 18F-FDG.

Résumé

Le nombre de patients atteints de maladie rénale en phase terminale, et le nombre de receveurs d'une allogreffe rénale augmente continuellement. Les épisodes de rejet aigu d'allogreffe cellulaire (AR) sont un facteur de mauvais pronostic pour la survie de l'allogreffe à long terme, et son diagnostic précoce est crucial pour la fonction allogreffe ^1. À l'heure actuelle, AR ne peut être définitivement diagnostiquée par biopsie à l'aiguille-aiguille, qui, comme une méthode invasive, découvre un risque important de blessure ou même la perte du greffon. De plus, les biopsies ne sont pas réalisables chez les patients prenant des anticoagulants et le site d'échantillonnage limité de cette technique peut entraîner des résultats faussement négatifs si l'AR est focale ou inégale. En conséquence, cela a donné lieu à une recherche permanente de nouvelles méthodes de détection AR, qui doit souvent être fait chez les animaux, y compris l'utilisation de différents modèles de transplantation.

Depuis le début des années 60, la transplantation rénale de rat est une méthode expérimentale bien établie pour l'examination et l'analyse des AR ^2. Nous ici présents en plus petit animal positron emission tomography (PET) avec ¹⁸ F-FDG (FDG) pour évaluer AR dans un uninéphrectomisés modèle transplantation rénale de rat allogénique et proposer imagerie FDG-PET greffe comme une nouvelle option pour un non-invasive, précise et le diagnostic précoce de l'AR aussi pour la situation humaine ^3. En outre, cette méthode peut être appliquée pour le suivi pour améliorer la surveillance du rejet de greffe ^4.

Protocole

1. Récupération de donneur d'organe

Mettre en place le microscope stéréotaxique, poids record de la semaine 8-10 rat (donneur et receveur poids corporel doit correspondre).
Anesthésier le rat donneur (Lewis Brown Norway F1, F1 LBN) utilisant de l'oxygène / inhalation isoflurane (isoflurane 4% / 2 L / min d'oxygène). Maintenir une anesthésie par isoflurane abaissement à 2-2,5%.
Placez le rat anesthésié sur le pavé de la chirurgie. Fixer les extrémités du rat avec du ruban adhésif sur le tampon et appliquer une pommade ophtalmique (Bepanthen, Bayer) aux yeux du rat.
Rasage et désinfecter l'abdomen du rat et d'effectuer une incision médiane ventrale du pubis à l'extrémité caudale du foie. Exposer le rein gauche et ses navires en déplaçant soigneusement l'intestin vers le côté droit. Placez une feuille mince de gaze sur le rein gauche et l'humidifier avec une solution saline isotonique réchauffé pour éviter la dessiccation.
Disséquer soigneusement le tissu adipeux avec Dumont Forceps de pointe est inclinée (SS-Dumont45 Forceps Inox médical, Outils Fine Science, art 11203-25) enveloppant l'uretère gauche. Évitez tout contact direct avec l'uretère, au contraire, mobiliser suffisamment les tissus environnants graisse.
Séparez la veine rénale gauche de l'artère rénale en utilisant Dumont forceps de pointe est inclinée. Retirez tous les tissus adipeux et conjonctif de deux navires et cautériser les vaisseaux surrénales et des testicules.
Disséquer l'aorte et la veine cave inférieure (VCI) au-dessus et au-dessous de sa jonction avec l'artère rénale gauche et la veine, respectivement, et cautériser toutes les artères sortants.
Fixer l'aorte sus-rénale avec une pince de microchirurgie (Micro Serrefines, Outils Fine Science, art 18055-04) au-dessus de l'artère rénale gauche, aussi près que possible de l'artère mésentérique supérieure. Ligaturer l'aorte sous-rénale utilisant la soie chirurgicale (5-0, Vömel, réf. 14739) environ 5 mm au-dessous de l'artère rénale gauche.
Ligaturer la veine cave inférieure rénal avec de la soie chirurgicale (5-0, Vömel), et serrer la VCI surrénaleavec une pince de microchirurgie (Micro Serrefines, Outils Fine Science, art 18055-03).
Couper la veine rénale aussi près que possible de l'IVC l'aide de ciseaux fins (Iris Ciseaux - ToughCut droite 11,5 cm, Outils Fine Science, art 14058-11).
Perfuser lentement le rein in situ avec 2 solution de perfusion HTK glacée ml (CUSTODIOL HTK, le Dr Franz Köhler Chemie) par l'insertion d'une canule (Microlance 3 27G ¾, BD, art 302200) dans le aorte sous-rénale. Assurez-vous que les changements de couleur rénales (maintenant olivâtre).
Tout d'abord, transect l'aorte surrénale, puis l'aorte et enfin l'uretère aussi proche que possible de la vessie.
Enlever le rein et sa vascularisation avec l'uretère et le ranger dans la solution de perfusion HTK sur la glace.
Euthanasier le rat des bailleurs de fonds en enlevant les pinces vasculaires et l'excision consécutive du cœur sous anesthésie.

2. Bénéficiaire préparation et la transplantationtion

Mettre en place le microscope stéréotaxique, poids record du rat.
Anesthésier le rat destinataire (Lewis) en utilisant l'isoflurane 4%. Maintenir une anesthésie par isoflurane abaissement à 2-2,5%.
Placez le rat anesthésié sur le pavé de la chirurgie. Fixer les extrémités du rat avec du ruban adhésif sur le tampon et appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux du rat `. Surveillance et contrôle de la température centrale du corps en utilisant un capteur de température rectale et un coussin chauffant. Pendant la chirurgie contrôler répétitive température, la respiration et le rythme cardiaque de l'animal.
Rasage et désinfecter l'abdomen et d'effectuer une incision médiane ventrale du pubis à l'extrémité caudale du foie. L'utilisation d'un scalpel forcutting la peau afin de minimiser le traumatisme de la peau. Exposer le rein gauche et ses navires en déplaçant l'intestin vers le côté droit.
Retirez délicatement la capsule rénale utilisant Dumont forceps de pointe est inclinée et des cotons-tiges.
Obstruer l'artère rénale gauche, la veine et de l'uretère à proximité de l'insuffisance rénalehile avec deux ligatures avec du fil chirurgical (Mersilene 4-0, Ethicon, cat. no. EH6732H). L'excision de la plus grande partie du rein, ne laissant que l'hile rénal. Nettoyer la surface de coupe avec des cotons-tiges et vérifier les saignements. Ajouter un autre ligature si nécessaire.
Disséquer soigneusement carrément à travers le tissu conjonctif qui couvre la aorte et la veine cave caudale sur le site avec des cotons-tiges.
Séparez toute nerf visible de l'aorte et la veine cave utilisant Dumont forceps de pointe est inclinée.
Disséquer soigneusement à travers la feuille de tissu conjonctif entre l'aorte et la veine cave, en formant deux ouvertures de longueur 4.2 mm: Le dessous de la première ramification des vaisseaux testiculaires, et la seconde une au-dessus de la ramification des vaisseaux iliaques primitives. Cautériser les artères et les veines iliolombaires entre les deux.
Dessinez un seul fil chirurgical (Mersilene 0;. Ethicon, chat no.EH6665E) par chacune des deux ouvertures. L'utilisation de ces discussions tirent la infrarénaleaorte et la veine cave en douceur vers le côté droit de l'animal pour avoir accès aux navires de ramification sur le site dorsale. Cautériser un de ces bateaux entre les deux ouvertures et retirer les fils chirurgicaux par la suite.
Ensuite, boucher l'aorte et IVC par l'application horaire de quatre pinces de microchirurgie (Micro Serrefines, Outils Fine Science, art 18055-04) commençant à l'ouverture supérieure de l'aorte et se terminant avec la veine cave supérieure à l'ouverture (Micro Serrefines , Outils de belle science, art 18055-03).
Ensuite soigneusement percer la fin supérieure de la partie isolée de l'aorte avec une aiguille (27G Microlance 3 ¾, BD, art 302200), insérer la lame inférieure des ciseaux de printemps fine (Vannas Ciseaux de printemps - 3 mm Lames, Beaux Sciences outils, cat.no 15000-00) à travers l'ouverture de ponction et d'effectuer une incision longitudinale brève. Rincez l'aorte isolée avec une solution de perfusion HTK-froid glace pour enlever toute trace de sang restant.
De même, soigneusement percerla terminaison inférieure de la partie isolée de la veine cave par une aiguille, à insérer la lame inférieure d'un ciseau à ressort bien à travers l'ouverture de la perforation et à effectuer une incision longitudinale se terminant peu au-dessous de l'incision aortique. Encore une fois, rincer la cuve pour éliminer toute trace de sang restant.
Retirer la greffe de rein de la solution de stockage. Placez-le au-dessous de l'ancien poste du rein gauche, et de s'assurer qu'il est correctement orienté.
Vérifiez l'orientation de l'artère rénale des greffes et s'assurer qu'il n'y a pas de rebondissements. Ensuite, placez une feuille mince de gaze sur la greffe et l'humidifier avec une solution de perfusion HTK glacée pour le refroidir, et pour éviter la dessiccation.
Fixer l'ouverture de la partie surrénale de la pièce aortique dans laquelle l'artère rénale du greffon s'ouvre sur de fil chirurgical (Ethilon 9-0, Ethicon, chat sans 2809G..) - D'abord à la partie supérieure, puis à l'extrémité inférieure de l'incision de l'aorte. Fermer l'incision dans le sens horaire avec une suture continue avec du fil chirurgical(Ethilon 9-0), Dumont forceps de pointe est inclinée et un porte-aiguille Castroviejo courbe (Outils Fine Science, cat. No. 12061-01). Ensuite, couvrir la première suture avec le tissu conjonctif par une seconde suture continue dans le sens antihoraire. Or, seule la partie inférieure de la pièce de la greffe aortique reste à être fermée. Régulièrement refroidir la greffe avec une solution de perfusion HTK froid glace.
Perfuser le greffon avec 1 ml de solution de perfusion HTK à froid de la glace à travers une aiguille émoussée inséré dans l'extrémité ouverte de la pièce de greffe aortique valider l'étanchéité et l'intégrité du fil de suture, tout en éliminant le sang restant dans le greffon. Ensuite, ligaturer l'extrémité ouverte de la pièce aortique avec de la soie chirurgicale (5-0, Vömel).
Vérifiez l'orientation de la veine rénale des greffes et s'assurer qu'il n'y a pas de rebondissements.
Fixer l'ouverture de la veine de la greffe avec du fil chirurgical (Ethilon 9-0) - d'abord à la partie supérieure, puis à l'extrémité inférieure de l'incision à la veine cave. Fermer l'incisiondans le sens horaire avec une suture continue avec du fil chirurgical (Ethilon 9-0), Dumont forceps de pointe est inclinée et un porte-aiguille Castroviejo courbe. Régulièrement refroidir la greffe avec une solution de perfusion HTK froid glace.
Antihoraire retirer les pinces de microchirurgie, en commençant par la veine cave supérieure pince. Après avoir enlevé la dernière clamp aortique, arrêter une hémorragie soigneusement finalement doux avec des cotons-tiges. Après quelques secondes, la greffe se tournera rose-teintées, et les contractions uretric devrait apparaître.
Pour l'insertion de l'uretère de greffes dans la vessie de l `destinataire retirez délicatement une petite parcelle de la musculature au sommet de la vessie à l'aide d'un ciseau de printemps Vannas (Student Vannas ciseaux de printemps droites, Outils Fine Science, art 91500-09 ). Ensuite, retirez le tissu environnant (essentiellement la graisse) de l'uretère par greffage utilisant Dumont forceps de pointe est inclinée. Par conséquent, prenez soin de la pointe de l'uretère et doucement séparer la graisse, le tissu conjonctif environnant et les vaisseaux embarqués from, il en les tirant dans la direction opposée. Fixer la pointe uretric à l'extrémité d'un fil chirurgical (Prolene 6-0, Ethicon, cat. No. 8697H) et perforer le haut préalablement préparée de la vessie avec l'aiguille fixée. Tirez l'uretère à travers la vessie et le quitter à la base à travers une deuxième perforation.
Fixer le préalable de l'uretère tissus séparés au sommet de la vessie avec du fil chirurgical (Ethilon 9-0). Couper le bout de l'uretère avec le fil chirurgical ci-joint et tirer l'uretère arrière dans la vessie en poussant délicatement vers le bas. Ensuite, fermez le deuxième ponction de la vessie avec du fil chirurgical (Ethilon 9-0).
Près de la paroi abdominale et de la peau par deux sutures continues mais séparées à l'aide de fil de suture chirurgical (Mersilène 0). Désinfecter la plaie à l'aide d'iode Pividon et administrer la buprénorphine (0,1 mg par kg / BW / bid) sc pendant trois jours après la chirurgie pour contrôler la douleur de la plaie.

3. Imaging rejet d'allogreffe

Anesthésier rat non à jeun en utilisant l'isoflurane 2-2,5%.
30 MBq FDG (30 MBq FDG dans 0,1 ml de NaCl à 0,9%) est administré par voie intraveineuse par cathétérisme d'une veine latérale de la queue à l'aide d'un cathéter 24 G (Braun, Introcan, 4252500-01). Par la suite, purger le cathéter avec une solution de 0,9 ml de NaCl 0,9%.
Laissez le rat dans un dispositif de retenue sans anesthésie jusqu'au début du balayage et hydrater l'animal par injection intraveineuse de 1 ml de solution de NaCl à 0,9% horaire.
Rat Re-anesthésier immédiatement d'utiliser l'isoflurane 2% avant la numérisation commence.
Placez rat anesthésié dans une chambre haute résolution basée sur plusieurs fils animal de compagnie caméra quadHIDAC (Oxford Positron Systems Ltd, Oxford, Royaume-Uni). La résolution spatiale de l'analyseur de PET est de 1,0 mm et est constant sur l'ensemble du champ de vue (diamètre 165 mm, longueur axiale, 280 mm). Surveillance et contrôle la température du corps au cours du balayage à l'aide d'un capteur de la température rectale et de l'anesthésie de commande avec un oxymètre d'impulsion.
Commencez acquisition dynamique pour 60 mà partir de 180 min après FDG-injection pour réduire l'accumulation du traceur dans les reins causées par l'excrétion rénale du FDG.
Appliquer 5 ¹⁸ MBq de fluorure F-IV et effectuer un autre TEP immédiatement après l'injection ¹⁸ F-fluorure pendant 60 minutes sans déplacer la position du rat dans le scanner d'identification de parenchyme rénal et pour le calcul du ^F-18 dégagement ^5. Reconstruire des images à partir de deux scans. Tracer manuellement un volume d'intérêt (VOI) sur les images reconstruites 2 min après injection ¹⁸ F-fluorure (perfusion phase) autour cortex rénal et de transférer le VOI aux images FDG. Exclure soigneusement le bassinet du VOI. Reconstruire des images à partir de deux scans et de tracer manuellement un volume d'intérêt (VOI) autour cortex rénal. Données en mode liste ont été reconstituées en images avec une taille de voxel de 0,4 × 0,4 × 0,4 mm ^3. Exclure soigneusement le bassinet du VOI.
Calculer FDG par le rapport of comptes totaux et le volume et calculer le pourcentage de la dose injectée (% ID). Nous avons utilisé MATLAB (version R2011b, MathWorks, Natick, MA, USA) et imagerie tomographique (TIM) Version 2.8 pour l'analyse d'image.