Dans le modèle animal décrit dans notre travail actuel, purifié des anticorps IgG contre un tronçon de 200 acides aminés (aa 757-967) de collagène VII sont injectés à plusieurs reprises dans des souris reproduisant le phénotype des cloques ainsi que les caractéristiques de l'histo-et immunopathologiques caractéristiques pour la santé humaine l'épidermolyse bulleuse acquise (EBA) 1.
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Article de méthode
Granulocytes-dépendante boursouflures la peau induite par autoanticorps
Dans cet article
Résumé
Résumé
Phénomènes auto-immunes surviennent chez des personnes en bonne santé, mais quand la tolérance au soi échoue, la réponse auto-immune peut entraîner une pathologie spécifique. Selon Witebsky postulats, l'un des critères de diagnostic d'une maladie auto-immune est que la reproduction de la maladie chez les animaux de laboratoire par le transfert passif d'autoanticorps. Pour l'épidermolyse bulleuse acquise (EBA), un prototype spécifique d'organe maladie auto-immune de la peau et des muqueuses, plusieurs modèles expérimentaux ont été récemment mis en place. Dans le modèle animal décrit dans notre travail actuel, purifié des anticorps IgG contre un tronçon de 200 acides aminés (aa 757-967) de collagène VII sont injectés à plusieurs reprises dans des souris reproduisant le phénotype des cloques ainsi que les caractéristiques de l'histo-et immunopathologiques caractéristiques pour la santé humaine EBA 1. Véritable maladie répandue est généralement considérée 5-6 jours après la première injection et l'étendue de la maladie est en corrélation avec la dose administrée de la collagen VII IgG spécifiques. Les lésions tissulaires (formation de bulles) dans le groupe expérimental EBA est en fonction sur le recrutement et l'activation des granulocytes par des tissus assortis autoanticorps 2, -4. Par conséquent, ce modèle permet la dissection de la voie de granulocytes-dépendante inflammatoire impliquée dans les lésions tissulaires auto-immunes, comme le modèle ne reproduit que la cellule T-indépendante phase de la réponse auto-immune efférente. De plus, sa valeur est soulignée par un certain nombre d'études démontrant le potentiel blister induisant des anticorps in vivo et étudier le mécanisme de la formation de bulles dans l'EBA 1,3, -6. Enfin, ce modèle va grandement faciliter le développement de nouvelles thérapies anti-inflammatoires dans les maladies provoquées par des auto-anticorps. Dans l'ensemble, le modèle de transfert passif des animaux de l'EBA est un modèle de la maladie accessible et instructif et aidera les chercheurs à analyser non seulement la pathogenèse EBA mais pour répondre fondamentale biologiquement et cliniquementdes questions d'auto-immunité essentielles.
Protocole
1. Préparation de l'anticorps pathogène
Remarque: La purification et la concentration des anticorps doit être effectuée le même jour, que les anticorps ne doivent pas être stockés dans la glycine 0,1 M pH 2,5 à 3 (tampon d'élution) pendant la nuit (ON).
La purification par affinité des IgG: utiliser 25 ml de sérum de lapin immunisé:
- Décongeler le sérum de lapin ON à 4 ° C, le mélanger 1:1 avec 1xPBS (tampon de migration) et centrifuger à 1260 xg pendant 10 min à 20 ° C. Éventuellement, une étape de filtrage avec du papier filtre pourraient être inclus après centrifugation dans le cas où le sérum est gras.
- Pendant ce temps, lavez la protéine G matrice remplie la colonne avec 10 volumes de lit (volume de lit = volume de la matrice) de 1XPBS (tampon de migration).
- Appliquez le sérum dilué et filtré à la colonne et incuber pendant 1 h sur un agitateur oscillant à la température ambiante (RT).
- Recueillir le flux continu (FT) dans un tube de 50 ml Flacon. Ne pas le jeter jusqu'à ce que la concentrationet le titre des IgG purifiée est connue.
- Laver la matrice avec 5 volumes de lit de 1XPBS et en même temps préparer 50 ml tubes Falcon de collecte de la fraction éluée des IgG. Pipette 1 ml de tampon de neutralisation du pH: Tris 1 M pH 10 dans chaque tube (autrement la proportion de 1:20 tampon TRIS par rapport à la quantité d'éluat à collecter).
- Appliquer 100-150 ml de tampon d'élution: 0,1 M de glycine à pH 2,5-3 et reçois la colonne 50 ml fraction (s). Retournez le tube de 2-3x, mesurer le pH et ajouter tampon de neutralisation jusqu'à ce que vous avez atteint le pH 7,2-7,4.
- Recueillir quelques gouttes d'éluat IgG et en utilisant le tampon d'élution comme étalon de mesurer la DO à 280 nm. Si la DO est la collecte
- Régénérer la matrice protéine G et le stocker en suivant les instructions du fabricant.
Concentration par ultrafiltration Amicon avec des tubes:
- Laver l'Ultra Amicon (15 ml / 30 kDa) des tubes d'ultrafiltration par centrifugation avec 1XPBS 15-20 minà 3220 xg à 4 ° C. Jeter le FT de la Amicon.
- Remplissez les Amicons avec 15 ml d'IgG fraction éluée et centrifuger pendant 25-30 min à 3220 xg et à 4 ° C, le temps de centrifugation dépend toujours de la teneur en protéines de l'éluat.
- Jeter FT et répétez jusqu'à ce ultrafiltration vous n'avez pas de fraction éluée à gauche.
- Laver le concentré d'IgG largement, à deux reprises, avec 1XPBS 25-30 min par centrifugation.
- Recueillir le "collant", solution d'anticorps jaunâtre du filtre Amicon dans un volume final de 1500-2000 ul de 1XPBS.
- Mesure de la concentration préparation d'IgG aide d'un spectrophotomètre ou NanoDrop:
Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x facteur de dilution / 1,4 - Nettoyez et rangez les Amicons en suivant les instructions du fabricant.
2. L'injection de collagène VII IgG spécifiques dans Souris
Avant de commencer la procédure expérimentale réelle, assurez-vous que le pro expérimentaleprotocole est rédigé et tous les matériaux sont préparés pour l'expérience.
- Préparer les feuilles de données pour la notation des maladies, ELISA, immunofluorescence (IF) l'analyse et la myéloperoxydase (MPO) test 4.
- Etiqueter les tubes pour le sang et les organes, cryomolds ainsi que l'histologie traitement et l'incorporation de cassettes.
- Les solutions d'anticorps doivent être préparés frais ou décongelé des stocks et caractérisé à l'égard de leur réactivité (titre par microscopie IF et / ou ELISA). La solution filtrée stérile d'anticorps doit être dilué dans du PBS de façon que la dose requise pour l'injection varie entre 250-1000 pl. Assurez-vous que vous avez assez d'IgG d'effectuer toute l'expérience.
- Préparer une nouvelle anticoagulant: héparine de 20 U / ml et 8,7 mg / ml de kétamine / xylazine 1,3 mélange mg / ml pour l'anesthésie. Lorsque le sacrifice des souris ont marqué les tubes avec du formaldéhyde 3,7% préparée.
- Stériliser les instruments chirurgicaux (scalpel, ciseaux, pointe fine et Curvforcipes ndlr) et de préparer les seringues (seringues à insuline, 1 et 2 seringues ml), aiguilles, appareil photo numérique et une carte mémoire supplémentaire.
Remarque: Effectuez toutes les procédures de kétamine / xylazine ou à l'isoflurane souris narcotized L'isoflurane est l'option préférée anesthésie pour les contrôles quotidiens de la peau, comme des souris de récupérer rapidement.. Toutefois, lorsque vous prenez des photos, 87 mg / kg de kétamine et 13 mg / kg de xylazine est habituellement injecté par voie sous cutanée. Pour l'euthanasie de la dose de kétamine / xylazine est augmentée à 130 mg / kg de kétamine et 20 mg / kg de xylazine.
- Vérifiez les animaux déjà marqués pour leur état de santé général, la peau et l'apparence de la fourrure, les peser et mesurer leur épaisseur de l'oreille (toujours s'en tenir à la même oreille).
- S'inscrire valeurs observées et des changements dans la fiche d'évaluation clinique.
- Recueillir 20-30 ul (2-3 gouttes) le sang de la veine de la queue dans une seringue contenant le même volume d'anticoagulant.
- Désinfecter la fourrure etpeau à l'aide d'éthanol à 80%.
- Injecter la solution d'anticorps voie sous-cutanée dans le dos à l'aide d'une seringue à insuline. (Pour certains sites (par exemple, les oreilles) que de faibles volumes (10-50 pi) sont réalisables à injecter.)
Les injections doivent être répétées tous les deux jours, 4 fois. Balb / c et souris C57BL6 d'un poids d'environ 20 g de commencer à développer la maladie 3-4 jours après la première administration de 400-500 jusqu'à 750 pg / g de poids corporel / injection auto-anticorps.
Lors de la finition de l'expérience:
- Mettez la souris sous narcose profonde en injectant 130 mg / kg et 20 mg / kg de kétamine / xylazine voie sous-cutanée, les être exsangue de la veine cave postérieure et arracher le coeur.
- Recueillir des échantillons de tissus / organes tels que la peau: queue, les oreilles, le sang et l'œsophage et les mettre dans des tubes préalablement marquées et le formaldéhyde, ou 3,7% de PBS remplie.
En revenant à l'laboratoire:
- Centrifuger le sang à 1200 xg, 10 min à température ambiante pour séparer le plasma, transférer le plasma dans des tubes correctement étiquetés et les stocker en conséquence.
- Intégrer la biopsie cutanée en milieu Cut température optimale en utilisant cryomolds, étiqueter correctement, et de les stocker à -80 ° C.
- Placer les échantillons de tissus destinés à l'histologie dans les moules d'enrobage étiquetés et les conserver dans du formol à 3,7% jusqu'à inclusion en paraffine.
3. Évaluation clinique de la gravité de la maladie
Les souris doivent être examinées quotidiennement pour les lésions de la peau et des muqueuses, et les résultats doivent être enregistrés en utilisant les formulaires appropriés. Les critères d'euthanasie précoce les lésions cutanées qui affectent plus de 20% de la surface du corps et une perte de poids de 5-10% du poids total du corps en trois jours consécutifs, comptant pour un score de maladie 5 (Tableau 1).
- Placez la souris sur le ventre. Commencez avec la région de la tête, à savoir le droitoreille et vérifier les ampoules, les érosions, la croûte sur la face interne ainsi que sur le côté extérieur. Continuer de la même façon avec l'oreille gauche.
- Yeux droit et gauche sont contrôlés pour les signes d'érythème, alopécie, des érosions et / ou croûte.
- Le front et la zone de museau sont brossés prochaine, pour continuer avec la partie ventrale du museau, les lèvres et la muqueuse de la bouche.
- Examiner la patte avant droite à partir de la patte, se déplaçant vers le haut; passer à la patte avant gauche. Même procédure avec les jambes droite et gauche de derrière.
- Brosse à travers la fourrure sur le cou et le dos domaine avec une pince courbe à pointe fine.
- Retournez la souris sur le dos et vérifier la partie ventrale ainsi que les côtés ventrales des membres de la même manière que précédemment.
- Vérifiez la queue.
- Prenez des photos de parties du corps sur lesquelles les souris développent une maladie. Une attention particulière doit être accordée à la qualité et la quantité des images.
- Calculer les scores cliniques de la maladie.
4. Analyse des échantillons de peau et Plasma
- Préparer, stocker et / ou de traiter tous les tissus prélevés selon le plan.
- Couper les coupes de tissus congelés pour IF détection des anticorps de lapin et de souris composants du système du complément.
- Analyser le contenu en protéines et enzymes différentes (test FTU) de gelée de tissus et / ou des extraits d'organes.
- Section du tissu inclus en paraffine et colorer avec H & E pour visualiser l'étendue des lésions tissulaires.
- Analyser le plasma par ELISA, immuno-empreinte.
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Résultats
Le transfert passif d'anticorps spécifiques d'antigènes résultats dans une maladie épanouie chez la souris, ressemblant à des niveaux cliniques, histologiques et immunopathologiques l'ABE humaine. Cloques, de croûtes, des érosions et alopécie se développer sur les oreilles, le museau, les pattes, les jambes, le dos et autour des yeux des souris. Les premiers signes cliniques de la maladie sera très probablement apparaître dans les oreilles et / ou de la zone tête. Le dépôt de spécifique IgG de lapin, la sour...
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Discussion
Le transfert passif d'anticorps chez des animaux de laboratoire est une approche importante pour démontrer leur pathogénicité 7, -12. Les modèles animaux obtenus grâce à cette méthode, en plus d'être l'une preuve indirecte de l'auto-immunité 13, permettre à l'enquête de la phase efférente du mécanisme pathogène. Le modèle de transfert passif d'anticorps induite par des granulocytes-dépendante la peau des cloques sur l'épidermolyse bulleuse acquise (EBA) a été utilisé pou...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le soutien par des subventions du SI-1281/4-1 Deutsche Forschungsgemeinschaft et ESBIO de la Faculté de médecine de l'Université de Fribourg (pour CS).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| antigène recombinant | L'encodage des plasmides pour les formes recombinantes de murin du collagène VII sont disponibles auprès de l'auteur correspondant. | ||
| sérum de lapin immunisé | www.eurogentec.com | Nous avons eu lapins New Zealand White immunisées avec 200 pg d'antigène, 3 fois à 2 semaines d'intervalle. À cette fin, nous avons utilisé les services d'Eurogentec SA, Belgique. | |
| Protéine G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Souris Balb / c | Charles River Laboratories | ||
| Composé OCT, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | PTOM, la température de coupe optimale |
| Cryomold norme | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Cryomold intermédiaire | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Traitement de l'histologie et de cassettes d'encastrement |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund & Richard Herberholz GmbH & Co. KG | 71492000 | tatouage pâte |
| Tatowierzange TZ1 | Ebeco E. Becker & Co GmbH | tatouage dispositif | |
| L'héparine | Carl Roth GmbH & Co. | 7692.1 | |
| Formaldéhyde 37% | Carl Roth GmbH & Co. | 7386 | |
| Le chlorhydrate de kétamine | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Chlorhydrate de xylazine | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| PBS stérile | Biochrom | L182-50 | |
| appareil photo numérique | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Seringue entraînée unité de filtre de 0,45 um | Millipore | ||
| Pied à coulisse | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributeur) |
| feuille de pointage maladie | Par exemple enclosed |
Références
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Réimpressions et autorisations
