L'examen de sélection positive et négative thymique par cytométrie en flux

Summary

Nous présentons une cytométrie de flux basé sur la méthode pour examiner le développement des cellules T In vivo En utilisant des souris génétiquement manipulées sur un fond de type sauvage ou récepteur des cellules T transgéniques.

Abstract

Un système immunitaire sain nécessite que les cellules T répondent aux antigènes étrangers tout en restant tolérant aux antigènes du soi. Réarrangement aléatoire du récepteur des cellules T (TCR) α et β loci génère un répertoire de lymphocytes T avec la grande diversité dans la spécificité d'antigènes, à la fois pour soi et étranger. Sélection du répertoire au cours du développement dans le thymus est essentiel pour générer sûrs et utiles lymphocytes T. Les défauts de la sélection thymique contribuer au développement de maladies auto-immunes et de l'immunodéficience ^1-4.

Progéniteurs des cellules T entrez le thymus que double négatifs (DN) thymocytes qui n'expriment pas CD4 ou CD8 co-récepteurs. L'expression de la αβTCR et les deux co-récepteurs se produit à la double positif (DP) scène. L'interaction de la αβTCR avec l'auto-peptide-CMH (pMHC) présenté par les cellules thymiques détermine le sort de la thymocytes DP. Interactions de haute affinité conduire à une sélection négative et éliminationtion des matières autoréactives thymocytes. Faible affinité des interactions se traduisent par une sélection positive et le développement de CD4 ou CD8 simples positives (SP) des lymphocytes T capables de reconnaître des antigènes étrangers présentés par CMH du soi ^5.

La sélection positive peut être étudiée chez la souris avec un anticorps polyclonal (type sauvage) répertoire de TCR en observant la génération de cellules T matures. Cependant, ils ne sont pas idéales pour l'étude de la sélection négative, ce qui implique la suppression de petites populations spécifiques de l'antigène. De nombreux systèmes modèles ont été utilisés pour étudier la sélection négative, mais varient dans leur capacité de récapituler les événements physiologiques ^6. Par exemple, la stimulation in vitro des thymocytes manque de l'environnement thymique qui est intimement impliqué dans la sélection, tandis que l'administration de l'antigène exogène peut conduire à la non-spécifique suppression des thymocytes ^7-9. À l'heure actuelle, les meilleurs outils pour l'étude de la sélection négative vivo sont des souris qui expriment une transgenic TCR spécifique pour endogène auto-antigène. Toutefois, de nombreux modèles classiques TCR transgéniques sont caractérisées par prématurée expression transgénique de la chaîne TCRα au stade DN, entraînant prématuré de sélection négative. Notre laboratoire a mis au point le modèle HY ^cd4, dans lequel le transgénique HY TCRα est conditionnellement exprimé au stade DP, permettant la sélection négative se produire lors de la DP à la transition SP comme c'est le cas chez les souris de type sauvage ^10.

Ici, nous décrivons une cytométrie de flux à base de protocole pour examiner thymique sélection positive et négative dans le modèle HY souris ^CD4. Bien que la sélection négative chez la souris ^cd4 HY est très physiologique, ces méthodes peuvent également être appliquées à d'autres modèles transgéniques TCR. Nous présenterons également les stratégies générales pour l'analyse de la sélection positive dans un répertoire polyclonal applicable à toutes les souris manipulées génétiquement.

Protocol

Reportez-vous à la figure 1 pour un schéma d'ensemble du protocole expérimental.

1. Dissection

1. Lieu écran stérile en maille d'acier plat 60 x 15 mm Petri. Une unité est nécessaire pour chaque échantillon de tissu.
2. Ajouter 5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à chaque plat. Garder les plats sur la glace.
3. Euthanasier les souris avec du CO _2.
4. Souris fixe sur une surface de dissection, face ventrale vers le haut. Souris de pulvérisation avec de l'éthanol 70% pour la stérilisation et à faire en sorte que la fourrure est emmêlée vers le bas.
5. Avec des ciseaux chirurgicaux, commencer la dissection en faisant une incision ventrale dans la peau de l'abdomen juste au-dessus des organes génitaux. Étendre vers le haut incision sous le menton.
6. De la ligne médiane, de prolonger l'incision le long de tous les membres. Tirez la peau lâche et épingler à la surface de dissection.
7. Récolter le thymus:
   1. Relever l'extrémité inférieure du sternum pour faire une incision.
   2. Éviter le foie, couper la membrane de détacher la cage thoracique, puis couper la cage thoracique de chaque côté. Couper vers le haut la cage thoracique de chaque côté, en prenant soin d'éviter les poumons et le cœur.
   3. Tirez doucement sur le dos cage thoracique avec une pince. Le thymus est un blanc, un organe bilobé situé au-dessus du cœur. En utilisant le côté plat de la pince pour saisir le fond des lobes, tirez doucement sur le thymus et le poser sur le tamis.
8. Récolter la rate:
   1. La rate est un rouge, en forme de planche de surf organe situé sur le côté gauche de la cavité abdominale de la souris, en dessous du foie.
   2. Faire une incision dans la cavité abdominale. Tirez doucement sur la rate avec une paire de pinces, en utilisant la deuxième paire de taquiner l'écart du tissu conjonctif. Placer la rate sur un tamis à mailles séparé.

2. Préparation des cellules

1. L'utilisation d'un piston d'une seringue de 3 ml, meulerorganes dans le tamis jusqu'à ce que le tissu conjonctif et les restes de graisse. Rincer avec du HBSS maille de la capsule trois fois. Utilisez un piston neuf pour chaque échantillon de tissu.
   1. D'autres options pour l'homogénéisation du tissu peut être utilisé à la place de cette méthode.
2. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
3. Cellules par centrifugation à 335 xg pendant 5 min à 4 ° C.
4. Splénocytes remettre en suspension dans 500 ul de tampon de lyse ACK (0,15 M NH ₄ Cl, 10 mM KHC0 _3, 0,1 mM Na ₂ EDTA, pH 7,2) pendant 10 min à température ambiante. Remettre les thymocytes à 20 x 10 ⁶ cellules / ml dans du tampon FACS (PBS, 1% de FCS, de l'azoture de sodium à 0,02%) et mis de côté sur la glace.
5. Retour splénocytes à l'isotonie par addition de 5 ml de HBSS. Splénocytes par centrifugation et remettre en suspension à 20 x 10 ⁶ cellules / ml dans du tampon FACS. Si les cellules ont besoin pour demeurer stérile, vous pouvez utiliser stérile du RPMI + 10% FCS.

3.Les cellules de coloration pour cytométrie en flux

Le but de ce protocole est de définir des stratégies pour l'analyse de la sélection positive et négative à l'aide de type sauvage (WT) et ^cd4 HY souris. Pour des considérations générales sur la cytométrie en flux expérimental, l'acquisition et l'analyse, nous renvoyons le lecteur à une excellente revue par Tung et al ^11.

1. Aliquoter 4 x 10 ⁶ thymocytes par échantillon cytométrie en flux à chaque puits d'une plaque de 96 puits, ainsi que 1 x 10 ⁶ splénocytes par WT commande de compensation. Si vous utilisez des souris transgéniques, vous devez inclure une souris WT comme témoin dans votre expérience.
2. Bloquer les récepteurs Fc par incubation des cellules avec anti-CD16/32 (clone 2.4G2) pendant 10 min sur la glace.
3. Faites tourner la plaque à 335 xg à 4 ° C pendant 5 min. Retirer le couvercle et dissiper liquide des puits en tapotant la plaque une fois, face vers le bas dans un évier. Resuspendre chaque puits dans 200 ul de tampon FACS. Répéter le lavage.
4. Préparer des cocktails d'anticorps indiquées ci-dessous, en utilisant la concentration optimale de chaque anticorps en fonction de la dilution dans 200 pi de tampon FACS par puits. La concentration optimale de chaque anticorps est définie comme la concentration minimale nécessaire pour obtenir la plus grande séparation des populations positives et négatives. S'il n'y a pas de population négative pour un anticorps donné, un anticorps isotype doit être inclus. Le volume total par puits peut être réduite (par exemple à 100 l par puits), si désiré.
   1. WT thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
   2. ^Cd4 HY thymus: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
      Pour obtenir une meilleure séparation des ^lo CD69 et CD69 ^hi populations de thymocytes, il est recommandé un anticorps biotinylé anti-CD69 primaire servir, suivie d'une tache secondaire contenant conjugué à un fluorochrome streptavidine. Nous usoi la même stratégie pour CD5 coloration.
5. Incuber les cellules avec 200 pi de cocktail d'anticorps dans un tampon de FACS pendant 30 min sur la glace dans l'obscurité.
6. Parallèlement à coloration cocktail d'anticorps, de la teinture chaque commande de compensation avec un seul anticorps conjugué à un fluorochrome. Idéalement, la coloration compensation implique que les mêmes anticorps utilisés dans le cocktail d'anticorps. Cependant, la coloration pour chaque antigène individuel peut ne pas être possible pour les grandes expériences lors de nombreux antigènes sont en cours d'analyse. Par conséquent, la coloration soit pour les anticorps anti-CD4 ou anti-CD8 est recommandé en raison de la forte expression de ces antigènes, ou l'utilisation de billes de rémunération. Colorer dans une mémoire tampon FACS pendant 30 min sur la glace dans l'obscurité. Laissez une commande de compensation non colorées.
7. Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS.
8. Resuspendre les cellules dans du tampon FACS et transfert à tubes FACS.
9. Prélever des échantillons sur cytomètre de flux. Comprennent l'acquisition de FSC-A et FSC-W à unllow de discrimination doublet.

4. Analyse des données de cytométrie en flux - Non-souris transgéniques TCR

Nous utilisons FlowJo pour la cytométrie en flux analyse des données. Reportez-vous à la figure 2A de la stratégie de déclenchement pour les souris transgéniques non-TCR.

1. Utilisation FSC-A par le SSC, portail électronique sur le "lymphocytes" de la population.
2. Dans le cadre du «lymphocytes» de la population, utiliser FSC-A par le FSC-W électroniquement la porte du FSC-W ^lo population d'exclure doublets cellulaires et aggregrates. Il s'agit de la «singulet» du portail.
3. Utilisation des événements dans le "singlet" porte, l'intrigue CD8 par le CD4. Dessinez portes pour DN, DP ^terne, DP ^lumineux, CD4 ⁺ CD8 populations ^lo, CD4SP et CD8SP comme le montre la figure 2B.
4. Sous les portes CD4SP et CD8SP, créer TCRβ par CD24 parcelles. Utilisez l'outil de déclenchement quadrant de tirer portes tel que représenté sur la figure 2C.
5. Créer un new complot de la "singlet" portail: TCRβ par CD69. Tirer portes A, B, C, D comme représenté sur la figure 2D.
6. Créer un nouveau complot de la "singlet" portail: TCRβ par CD5. Dessinez portes i, ii, iii, iv comme le montre la figure 2E. C'est une autre stratégie pour l'examen de sélection positive.
7. Appliquer DN, DP ^terne, DP ^{lumineux, int} CD4, CD4SP et CD8SP portes à partir de la rubrique «singulet» aux portes i, ii, iii, iv, A, B, C, D (figure 2D, E).
8. Calculer le nombre de cellules dans un sous-ensemble particulier en multipliant cellularité orgue de la fréquence de chaque porte subséquente jusqu'à ce que vous atteignez votre population cible. Par exemple, le nombre de TCRβ ^hi-CD69 CD8SP thymocytes serait déterminée par le thymus cellularité x% TCR bhi CD69-(fraction D) CD8SP% x.
   1. Compter prend déjà en compte les cellules vivantes et mortes afin de ne pas inclure le lymphoc "YTE «porte dans vos calculs.

5. Analyse des données de cytométrie en flux - TCR des souris transgéniques

Reportez-vous à la figure 3A pour la stratégie de déclenchement pour les souris transgéniques TCR.

1. Suivez les étapes 4.1 et 4.2 comme dans la section précédente.
2. Dans le cadre du «singulet» porte, créez un T3.70 par parcelle SSC et porte sur le T3.70 ⁺ population de cellules à analyser spécifiques de l'antigène des cellules T (figure 3B). Dans certaines circonstances, il peut être intéressant de comparer cette population à la non-specific antigen (T3.70-) population de cellules T.
3. Sein de la population T3.70 ^+, tirage DN, DP, CD4SP et CD8SP portes (figure 3C).
   1. Pour les échantillons de contrôle WT, dessiner ces portes sous la rubrique "singulet" portail ou créer un T3.70 porte car il y aura très peu de cellules T3.70 ^+.
4. Sous la porte CD8SP, créer unT3.70 par CD24 parcelle. Utilisez l'outil de déclenchement quadrant de diviser les cellules en quatre populations (figure 3F).
5. Créer un histogramme représentant superposée expression de CD69 dans le compartiment DP de souris WT et T3.70 ⁺ DP compartiment de souris ^cd4 HY (figure 4A). Répétez l'opération pour examiner CD5 expression (figure 4B).
6. Calculer le nombre absolu de cellules dans chaque sous-ensemble d'intérêt que dans 4,8.

Results

En physiologiques modèles transgéniques TCR et les souris WT, la sélection positive commence à l'étape DP ^lumineux avant de passer à l'étape DP ^terne après la rencontre antigène. Thymocytes DP ^ternes puis entrez un nombre de CD4 ⁺ CD8 étape de transition avant de devenir ^lo CD4SP ou thymocytes CD8SP (figure 2B). Thymocytes matures SP se caractérise par une forte expression du TCR et la perte du CD24 (figure 2C). Alors que le CD8 par...

Discussion

Le protocole présenté ici peut être utilisé pour examiner sélection positive et négative dans le non-TCR transgénique et TCR des souris transgéniques. Ce protocole décrit la coloration des antigènes de surface. Pour une analyse plus approfondie des mécanismes moléculaires, il est souvent nécessaire d'effectuer une coloration intracellulaire. Nous utilisons la BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit pour la plupart des protéines intracellulaires et le kit de BD Biosciences coloration pour des facteurs de transcription ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
HyClone Hank solution saline équilibrée	Thermo Scientific	SH30030.02
Tamis à mailles métalliques	Cedarlane	CX-0080-E-01
Des boîtes de Pétri (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Seringues (3 ml)	BD Biosciences	309657
Tubes coniques (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscope	Zeiss - Primo Star	415 500-00XX-000
Hémocytomètre	HausserScientifique	3110
Plaque de 96 puits	Sarstedt	82.1582.001
Pipette multicanaux	Fisherbrand	21-377-829
Sérum de veau foetal	AAP	A15-701
Tampon phosphate salin	Fisher Scientific	SH3025802
L'azoture de sodium	IT Baker Chemical Co.	V015-05
Réactif bloquant FcR			Clone 2.4G2
Anti-souris HY TCR	eBioscience	XX-9930-AA *	Clone T3.70
Anti-souris CD4	eBioscience	XX-0042-AA *	Clone RM4-5
Anti-souris CD8a	eBioscience	XX-0081-AA *	Clone 53-6.7
Anti-souris CD24	eBioscience	XX-0242-AA *	Clone M1/69
Anti-souris TCRβ	eBioscience	XX-5961-AA *	Clone H57-597
Anti-souris biotinylé CD69	eBioscience	13-0691-AA *	Clone H1.2F3
Anti-souris biotinylé CD5	eBioscience	13-0051-AA *	Clone 53-7.3
Streptavidine	eBioscience	XX-4217-AA *
Cytomètre en flux	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tubes	BD Biosciences	352052
Logiciel d'analyse de cytométrie en flux	Treestar - FlowJo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX varie selon le fluorochrome et YY varie selon la taille du flacon.