Génie tissulaire de l&#39;intestin dans un modèle murin

Erik R. Barthel; Allison L. Speer; Daniel E. Levin; Frédéric G. Sala; Xiaogang Hou; Yasuhiro Torashima; Clarence M. Wigfall; Tracy C. Grikscheit

doi:10.3791/4279

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Article de méthode

Génie tissulaire de l'intestin dans un modèle murin

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DOI :

10.3791/4279

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1 décembre 2012

Erik R. Barthel¹ , Allison L. Speer¹ , Daniel E. Levin¹ , Frédéric G. Sala¹ , Xiaogang Hou¹ , Yasuhiro Torashima¹ , Clarence M. Wigfall¹ , Tracy C. Grikscheit¹

¹Children's Hospital Los Angeles, Division of Pediatric Surgery, Saban Research Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California

Dans cet article

Résumé

Cet article et la vidéo qui l'accompagne présenter notre protocole pour générer génie tissulaire intestin chez la souris, en utilisant un organoïde unités-sur-échafaudage approche.

Résumé

Génie tissulaire intestin grêle (TESI) a été utilisée avec succès pour sauver des rats Lewis après une résection intestinale massive de petite, ce qui entraîne en retour de poids préopératoire dans les 40 jours ^1. Chez l'homme, massif résection de l'intestin grêle peuvent entraîner un syndrome du grêle court, une malabsorption fonctionnelle Etat qui confère une importante morbidité, la mortalité et les coûts des soins de santé, y compris la dépendance nutrition parentérale, l'insuffisance hépatique et de la cirrhose, et la nécessité d'une transplantation d'organe multiviscérale. ² Dans cet article, nous décrivons et documenter notre protocole pour la création par génie tissulaire intestin dans un modèle de souris avec un organoïde unités-sur-échafaudage approche multicellulaire. Unités sont organoïdes agrégats multicellulaires dérivées de l'intestin qui contiennent des éléments à la fois des muqueuses et mésenchymateuses, ³ la relation entre ce qui préserve la niche tige intestinale cellule. ⁴ Dans la recherche en cours et à venir, la transition de notre technique dans lesouris permettra d'enquête sur les processus impliqués lors de la formation TESI en utilisant les outils disponibles transgéniques chez cette espèce. ⁵ La disponibilité de souches de souris immunodéprimées nous permettra également d'appliquer la technique de tissu intestinal humain et optimiser la formation de TESI humain comme un xénogreffe de souris avant sa transition vers les humains. Notre méthode utilise bonnes pratiques de fabrication (BPF) des réactifs et des matériaux qui ont déjà été approuvés pour une utilisation chez des patients humains, et offre donc un avantage significatif par rapport aux approches qui reposent sur des tissus animaux décellularisé. Le but ultime de cette méthode est sa traduction à l'homme comme une stratégie thérapeutique pour la médecine régénérative syndrome de l'intestin court.

Protocole

1. Organoïde Préparation unités

Instruments appropriés pour la dissection de la souris (ciseaux et des pinces) doivent être stérilisés par autoclave.
Euthanasier sans douleur la souris donneuse selon les protocoles locaux IACUC. Assurez-vous que l'animal est mort avant de poursuivre.
Faire une incision médiane pour accéder à la cavité péritonéale. Lambeaux cutanés peuvent être présentées comme nécessaires pour améliorer l'exposition.
Eviscération l'intestin grêle et le diviser juste en aval du ligament de Treitz. Séparer l'intestin grêle de son mésentère utilisant nette et douce dissection. Identifier la jonction iléo-colique et de diviser l'intestin grêle proximal 5 mm à cela.
Avec des ciseaux, ouvrez l'intestin sens de la longueur le long de la frontière antimésentérique dans une boîte de Pétri avec 10 ml 4 ° C, une solution saline tamponnée stérile de Hanks (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiotique antifongique-(Anti-Anti, Invitrogen) solution. Effacer les matières fécales dans l'intestin ouvert avecagitation douce puis de transférer l'intestin a ouvert un tube à centrifuger 15ml avec 10 ml de 4 ° C, HBSS stérile / 1X anti-anti.
Laver l'intestin ouvert trois fois dans 10 ml de 4 ° C, HBSS stérile / 1X anti-anti-dans un tube à essai. Chaque lavage peut être effectué avec une agitation douce du tube de 15 ml pendant 30 sec. Après agitation, le tissu intestinal coule au fond du tube. Jeter les matériels flottants qui est des débris mésenchymateuse. Retirez soigneusement la solution de lavage avec une pipette.
Hachez l'intestin lavé dans une boîte de Pétri avec 10 ml de 4 ° C, HBSS stérile / 1X anti-anti-moins de 1 mm morceaux carrés en utilisant une paire de ciseaux. Rassemblez le matériel hachée avec une pipette automatique et le placer dans un tube à essai.
Centrifuger le tube à 500 tours par minute pendant 8 min. Jeter le surnageant, qui contient de la graisse et le mésenchyme.
Digérer le hachée, matériau lavé avec 10 ml de HBSS stérile / 1X anti-anti majoré de 0,125 mg / ml dispase (Invitrogen) et 800 unités / ml collagénase de type 1 (Worthington, Lakewood NJ). Pour préparer 40 ml de la solution de digestion, peser 5 mg de dispase, 142 mg de collagénase, et ajouter HBSS stérile jusqu'à un volume de 40 ml. Préparer cette solution fraîchement chacune des unités organoïdes temps sont préparés, et conserve à 4 ° C jusqu'au moment de servir. Ajouter la solution de digestion directement à l'étape de 1,8 à granulés.
Incuber le tube à essai contenant le hachée, la matière lavée avec la solution de digestion à 37 ° C pendant 20 min.
Récupérer le tube à essai et perturber encore davantage le tissu digéré par trituration avec une pipette de 10 ml. Répéter entre 20 à 50 fois jusqu'à ce qu'une apparence uniforme.
Centrifuger le tube à essai pendant 5 min à 800 rpm. Jeter le surnageant, qui contient des cellules individuelles.
Arrêter la réaction de digestion avec 10 ml de 4 ° C, stérile Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, Invitrogen) majoré de 10% v / v inactivé par la chaleur du sérum fœtal bovin (FBS-HI, Invitrogen). Reprendre le pellet et agiter le tube.
Centrifuger le tube à essai pendant 5 min à 800 rpm. Retirez soigneusement le surnageant avec une pipette automatique jusqu'à ce que les dernières gouttes. Utiliser une pipette en plastique jetable pour les dernières gouttes d'éviter la remise en suspension du culot.

2. Chargement de l'acide polyglycolique échafaudage

Formulaire de 2 mm de long, de 5 mm de diamètre échafaudages cylindriques extérieures de l'acide glycolique non-tissé (épaisseur de la tôle de 2 mm, 60 mg densité en vrac cm-3; porosité> 95%, Fibres Concordia, RI Coventry) tel que décrit dans la référence. 4.
Coupez l'extrémité distale de 2 mm d'une pipette jetable 1000 microlitre pointe avec des ciseaux préparés avec de l'éthanol à 70% dans de l'eau distillée.
Placez l'échafaud dans une plaque de culture de 4-bien. Chargez les unités organoïdes sur l'échafaud avec la pipette microlitre 1000, d'abord dans la lumière, puis sur la surface extérieure. Utiliser une pince pour assurer revêtement de la lumière. Ne pas perturber ou briser la forme cylindrique du polymère.

3. Implantation dans la souris hôte

Utiliser une souris hôte syngénique sur le fond même du donateur si disponible. Sinon, utiliser un diabétique non obèse immunodéprimés / grave déficit immunitaire combiné ou NOD / SCID animal (Jackson Laboratories, Sacramento CA).
Induire une anesthésie générale à l'isoflurane. Shave, la préparation et le drapé abdomen de la souris.
Faire une incision médiane de 5 mm pour pouvoir entrer dans la cavité péritonéale. Identifier et soigneusement vider le grand épiploon. Placer le polymère chargé sur l'épiploon et l'envelopper avec le tissu. Ne déchirez pas l'épiploon.
Obtenir le polymère à l'épiploon avec une suture 5-0 monocryl. Replacez doucement l'épiploon avec le polymère enveloppé dans sa position anatomique.
Fermer l'incision abdominale en couches en utilisant des sutures 4-0 vicryl. Exécutez la fermeture des muscles et prendre soin de ne pas blesser les viscères abdominaux dessous de l'incision. Utilisez des points séparés pour la peau.
Administrer une analgésie postopératoire de 2 mg / kg de kétoprofène (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) dans de l'eau stérile comme une papule cutanée à côté de l'incision. Les animaux doivent être évalués quotidiennement et si l'animal montre des signes de douleur ou de détresse, une dose supplémentaire de kétoprofène peut être administrée au jour post-opératoire 2. Le troisième jour postopératoire, l'animal doit être complètement récupéré sans signes de douleur ou de détresse. Si la douleur ou de la détresse continue le jour post-opératoire 3, ceci est considéré comme anormal et devrait être traitée en conformité avec les protocoles IACUC et de soins pour animaux.
Laissez la souris pour récupérer et l'intestin par génie tissulaire à croître pendant quatre semaines. Offrir l'accès à volonté des animaux annonce à rongeur (Laboratoire Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) et de l'eau avec Septra 200 mg / 40 mg pour 5 ml (Salut-Tech Pharmacal, Amityville NY) à 1:100 dilution.

4. Récolte

Humanely euthanasier l'animal hôte quatre semaines après l'implantation.
Rouvrir l'incision initiale et refléter la peau céphalique pour faciliter l'accès à la cavité péritonéale.
Ouvrez la couche musculaire et d'identifier la construction par génie tissulaire comme un globe de tissu.
Prenez les adhérences à la construction de viscères intra-abdominale à l'aide dissection.
Fixer la construction dans le formol pour le montage ultérieur de paraffine, ou d'utiliser le tissu frais pour les tests biochimiques tels que PCR en temps réel ou l'isolement des protéines.