Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

Emma Monte; Haodong Chen; Maria Kolmakova; Michelle Parvatiyar; Thomas M. Vondriska; Sarah Franklin

doi:10.3791/4294

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Article de méthode

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

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DOI :

10.3791/4294

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28 décembre 2012

Emma Monte¹ , Haodong Chen¹ , Maria Kolmakova¹ , Michelle Parvatiyar¹ , Thomas M. Vondriska¹^,²^,³ , Sarah Franklin¹^,⁴

¹Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ²Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, ³Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁴Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

Dans cet article

Résumé

Les progrès de la spectrométrie de masse ont permis l'analyse à haut débit de l'expression protéique et la modification dans une multitude de tissus. Combiné avec fractionnement subcellulaire et modèles de maladies, spectrométrie de masse quantitative et de la bioinformatique peut révéler de nouvelles propriétés dans les systèmes biologiques. Le procédé décrit ici analyse des protéines associées à la chromatine dans le cadre d'une maladie cardiaque et est facilement applicable à d'autres In vivo Modèles de maladies humaines.

Résumé

Dans le noyau résident les protéomes dont les fonctions sont le plus intimement lié à la régulation des gènes. Adulte noyaux des cardiomyocytes de mammifères sont uniques en raison du pourcentage élevé de cellules binucléées, ¹ l'état hétérochromatique principalement de l'ADN, et la nature non-division du cardiomyocyte qui rend noyaux adulte dans un état permanent d'interphase. ^{2 Régulation} transcriptionnelle au cours du développement et maladie ont été bien étudiés dans cet organe, ^3-5, mais ce qui reste relativement inexploré est le rôle joué par les protéines nucléaires responsables de l'empaquetage de l'ADN et de l'expression, et comment ces protéines contrôlent des changements dans les programmes transcriptionnels qui se produisent au cours de la maladie. ⁶ Dans les pays développés monde, les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité pour les hommes et les femmes ^7. Regard sur la façon dont les protéines nucléaires coopèrent pour réguler la progression de cette maladie est essentielle pour faire avancer le traitement actuel options.

La spectrométrie de masse est l'outil idéal pour répondre à ces questions car elle permet une annotation non biaisée de la quantification nucléaire protéome et relative de la façon dont l'abondance de ces protéines varie avec la maladie. Bien qu'il y ait eu plusieurs études protéomiques pour des complexes de protéines de mammifères nucléaires, ^8-13 jusqu'à récemment ^14, on a eu qu'une seule étude portant sur le protéome cardiaque nucléaire, et considéré comme le noyau entier, plutôt que d'explorer le protéome au niveau des compartiments nucléaires sous ^15. En grande partie, ce manque de travail est due à la difficulté d'isoler les noyaux cardiaque. Noyaux cardiaque ultérieure dans un semi-rigide et dense actine-myosine l'appareil auquel ils sont reliés par plusieurs extensions du réticulum endoplasmique, dans la mesure où la contraction des myocytes modifie leur forme générale. ¹⁶ En outre, les cardiomyocytes sont 40% en volume ¹⁷ mitochondries qui necessitàTES enrichissement du noyau mis à part les autres organites. Ici, nous décrivons un protocole d'enrichissement nucléaire cardiaque et un fractionnement supplémentaire en compartiments biologiquement pertinentes. En outre, nous avons détail les méthodes pour le label sans dissection spectrométrie de masse quantitative de ces fractions des techniques qui se prêtent à l'expérimentation in vivo dans divers modèles animaux et des systèmes d'organes où marquage métabolique n'est pas réalisable.

Protocole

Le flux de travail expérimental comporte sept étapes principales (figure 1). Pour tout travail impliquant des échantillons qui seront exécutés sur le spectromètre de masse, l'expérimentateur doit porter une blouse, des gants et un filet à cheveux et prendre soin d'éviter la contamination par la poussière et la chute personnelle de la kératine.

1. Homogénéisation coeur et isolement nucléaire

Coeurs de souris sont homogénéisés et un noyaux intacts culot est isolé (figure 2).

Sacrifiez la souris adulte, le cœur d'accise, rincer à PBS glacé, et homogénéiser ....