L&#39;élevage et de l&#39;injection de<em&gt; Manduca sexta</emLes larves&gt; pour évaluer la virulence bactérienne

Résumé

La méthode décrite ici utilise l'injection directe de bactéries entomopathogènes dans le hémocèle de Manduca sexta Les larves d'insectes. M. sexta Est un insecte disponible dans le commerce et bien étudié. Ainsi, cette méthode représente une approche simple pour analyser les interactions hôte-bactéries du point de vue de l'un ou des deux partenaires.

Résumé

Manduca sexta, communément connu sous le sphinx du tabac, est considéré comme un ravageur agricole important, se nourrissant de plantes solanacées, dont le tabac et la tomate. La susceptibilité de M. larves sexta à une grande variété d'espèces bactériennes entomopathogènes ^1-5, ainsi que la richesse des informations disponibles sur le système immunitaire de l'insecte ^6-8, et la séquence du génome attente ^{9 rendent} un organisme bon modèle pour une utilisation dans l'étude des interactions hôte-microbe au cours de la pathogenèse. En outre, M. larves sexta sont relativement grands et faciles à manipuler et à entretenir dans le rapport de laboratoire sensibles à d'autres espèces d'insectes. Leur grande taille facilite aussi efficace tissus / hémolymphe d'extraction pour l'analyse de la réponse de l'hôte à l'infection.

La méthode présentée ici décrit l'injection directe de bactéries dans le hémocèle (cavité sang) de M. larves sexta. Cette approchepeut être utilisé pour analyser et comparer les caractéristiques de virulence de diverses espèces bactériennes, les souches, ou des mutants par simple surveillance du temps de mort de l'insecte après l'injection. Cette méthode a été développée pour étudier la pathogénicité de Xenorhabdus et des espèces Photorhabdus qui associent généralement avec les nématodes vecteurs comme un moyen de gagner l'entrée dans l'insecte. Les nématodes entomopathogènes infectent généralement les larves via digestive naturelle ou orifices respiratoires, et de libérer leurs contenus symbiotiques bactériens dans l'hémolymphe des insectes (sang) peu de temps après ^10. Le procédé d'injection décrits ici contourne la nécessité d'un nématode vecteur, ainsi découpler les effets des bactéries et des nématodes sur les insectes. Cette méthode permet à l'énumération précise des matières infectieuses (cellules ou protéines) dans l'inoculum, ce qui n'est pas possible à l'aide d'autres méthodes existantes pour l'analyse entomopathogenesis, y compris entaille ¹¹ et des essais de toxicité orale ¹² L'utilité de la méthode d'injection directe comme décrit ici est d'analyser la pathogenèse bactérienne en surveillant la mortalité des insectes. Cependant, cette méthode peut facilement être étendu pour une utilisation dans l'étude des effets de l'infection sur la M. sexta système immunitaire. L'insecte réagit à l'infection par les deux réponses humorales et cellulaires. La réponse humorale comprend la reconnaissance de bactéries associées aux modèles et la production subséquente de plusieurs peptides anti-microbiens ^7; l'expression de gènes codant pour ces peptides peut être surveillée à la suite de l'infection directe par l'intermédiaire d'extraction d'ARN et PCR quantitative ^13. La réponse cellulaire à l'infection implique la nodulation, l'encapsulation et la phagocytose des agents infectieux par les hémocytes ⁶ 13, 14.

Protocole

1. Stérilisation des oeufs d'insectes et d'élevage

1. Préparer l'alimentation d'abord autoclave 15 g de gélose fournie dans 900-1000 ml H O. ₂ Immédiatement après passage à l'autoclave, le mélange avec 166 g de nourriture de germe de blé et bien mélanger dans un mélangeur de laboratoire. Verser dans un plat (ou des plats) pour refroidir, puis transfert à l'alimentation du papier d'aluminium, enveloppez hermétiquement et conserver à 4 ° C.
2. À l'arrivée, stériliser M. oeufs sexta avec 250 ml d'eau de Javel 0,6% pendant 2-3 min dans un porte-filtre en verre et appareils fiole à vide avec u....

Résultats

Un exemple représentatif d'un essai mortalité des insectes est représenté dans la figure 3. Dans cette expérience, les insectes ont été injectés avec environ 50 unités formant colonies (UFC) de l'une de type sauvage (ATCC19061) ou une souche mutante atténuée (lrp ¹³⁾ de Xenorhabdus nematophila grandi au milieu de la phase logarithmique (n = 6 insectes par souche). Les insectes ont été observés pendant environ 72 heures, et le pour cent des insectes injectés encore en.......

Discussion

L'injection directe de M. larves avec des bactéries entomopathogènes sexta, comme décrit ici, sert comme un moyen simple et efficace pour analyser la virulence bactérienne. La méthode est également très adaptable à différents sujets de l'expérience et / ou des conditions. Les bactéries peuvent être préparés de diverses façons avant l'injection. Dans le cas de X. nematophila, les cellules de type sauvage cultivées dans riche en nutriments Luria-Bertani (LB) à la mi-phase logarithmiq.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
90 Papier filtre mm	Whatman	1001 090
Porte-filtre en verre	Millipore	XX1004700
Manduca sexta oeufs	Caroline biologique Alimentation	143880
Diet spongieuse + agar	MP Biomédical	0296029301
5,5 oz contenants et couvercles de plastique	Solo Cup Company	URC55-0090-0090 PL4
1 oz contenants et couvercles de plastique	DART Container Corporation	100PC 100PCL25
1x PBS			137 mm de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4
Seringue	Hamilton	80208	Calibre 30, 0,375 "style de point de longueur, 2