Visualisation des bactéries dans nématodes en utilisant la microscopie à fluorescence

Summary

Pour étudier le mutualisme entre Xenorhabdus Les bactéries et Steinernema, des méthodes ont été développées pour contrôler la présence de bactéries et nématodes emplacement à l'intérieur. L'approche expérimentale, qui peut être appliquée à d'autres systèmes, ingénierie implique bactéries pour exprimer la protéine fluorescente verte et de visualisation, en utilisant des bactéries de microscopie par fluorescence dans le nématode transparent.

Abstract

Symbioses, le vivre ensemble de deux ou plusieurs organismes, sont répandues dans tous les règnes du vivant. Comme deux des organismes les plus répandus sur la terre, les nématodes et les bactéries forment un large éventail d'associations symbiotiques qui vont de bénéfique pour les pathogènes ^1-3. Une telle association est la relation mutuellement bénéfique entre les bactéries et nématodes Steinernema Xenorhabdus, qui a émergé en tant que système modèle de symbiose ^4. Nématodes entomopathogènes Steinernema sont, en utilisant leur symbiote bactérien pour tuer les insectes ^5. Pour la transmission entre les hôtes d'insectes, les bactéries colonisent l'intestin de l'étape du nématode infectieux juvénile ^6-8. Récemment, plusieurs autres espèces de nématodes a été démontré que les bactéries utilisent pour tuer les insectes ^9-13, et les enquêtes ont commencé à étudier les interactions entre les nématodes et les bactéries dans ces systèmes <sup> 9.

Nous décrivons une méthode pour la visualisation d'un symbiote bactérien dans ou sur un hôte de nématodes, profitant de la transparence optique de nématodes lorsqu'ils sont vus au microscope. Les bactéries sont modifiées pour exprimer une protéine fluorescente, ce qui permet leur visualisation par microscopie de fluorescence. Il existe de nombreux plasmides qui portent des gènes codant pour des protéines qui sont fluorescents à différentes longueurs d'onde (c.-vert ou rouge), et la conjugaison des plasmides provenant d'une souche d'Escherichia coli donateurs dans un symbiote bactérien destinataire est positive pour une large gamme de bactéries. Les méthodes décrites ont été développés pour étudier l'association entre Steinernema carpocapsae et Xenorhabdus nematophila ^14. Des méthodes similaires ont été utilisées pour étudier d'autres nématodes bactérie associations ^{9, 15-18} et l'approche est donc généralement applicable.

Le rencontréhod permet de caractériser la présence de bactéries et de localisation au sein de nématodes à des stades de développement différents, donnant un aperçu de la nature de l'association et le processus de la colonisation ^{14, 16, 19.} L'analyse microscopique révèle la fréquence de colonisation à l'intérieur d'une population et la localisation des bactéries aux tissus de l'hôte ^{14, 16, 19-21.} Il s'agit d'un avantage sur les autres méthodes de surveillance des bactéries au sein des populations de nématodes, tels que la sonication ²² ou meulage ^23, qui peuvent fournir des niveaux moyens de la colonisation, mais ne peut pas, par exemple, distinguer les populations avec une fréquence élevée de faibles charges symbiotes des populations une basse fréquence de charges élevées symbiotes. Discriminer la fréquence et la charge de bactéries colonisant peut être particulièrement important lors du dépistage ou de caractérisation de mutants bactériens des phénotypes colonisation ^{21, 24.} En effet, la microscopie à fluorescence a été utilisé dans criblage à haut débit de mutants bactériens pour les défauts de la colonisation ^{17, 18,} ​​et est moins pénible que les autres méthodes, y compris sonication ^{22, 25-27} et dissection des nématodes individuelle ^{28, 29.}

Protocol

1. Construction d'une souche bactérienne Fluorescent via Conjugaison

1. Croître la souche receveuse (symbiote à examiner) et souche donneuse du jour au lendemain. La souche donneuse, en général Escherichia coli, devrait être capable de donner l'ADN par conjugaison et doivent être transformées avec un. Plasmide (tableau 2) qui porte un gène codant pour une protéine fluorescente Selon le plasmide, une souche d'aide conjugaison peut également être nécessaire. Si c'est le cas, cette souche devrait également être cultivées pendant une nuit. La souche donneuse et de la souche d'aide doit être cultivé avec des antibiotiques à sélectionner pour le maintien du plasmide.
2. Repiquer le donateur, aide et souches receveuses en nutriments des milieux de croissance riches manquent antibiotiques dans un rapport 1:100 de la culture et moyennes entreprises.
3. Développer les cultures à la température appropriée pour chaque souche jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de croissance semi-logarithmique _(DO600 ~ 0,6). Pour Xenorhabdus et E. coli ce stade de croissancee est atteint environ 3 à 4 heures après repiquage. Cela peut varier en fonction de la souche, ou, dans certains cas, le plasmide utilisé.
4. Mélanger les souches dans un microtube et centrifuger 2 min à 17900 xg (13.000 rpm dans la plupart des microfuges). La proportion de donneur et du receveur qui donne les meilleurs résultats peuvent varier pour différentes combinaisons, et peut être déterminée de manière empirique. Pour un destinataire Xenorhabdus et E. coli donateurs, nous utilisons un mélange 3:1 ou 1:1. Si une souche d'aide est nécessaire (par exemple E. coli), il convient d'ajouter dans le même rapport que le donneur.
5. Décanter le surnageant.
6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 pl de milieu frais.
7. Repérez la suspension sur une plaque de milieux riches en nutriments sans antibiotiques, et de permettre l'endroit pour sécher.
8. Incuber la plaque, inversé, du jour au lendemain à une température optimale pour la bactérie receveuse et admissible pour le donateur (et d'un assistant, le cas échéant). La plaque doitêtre incubées au moins 18 heures.
9. Ramasser le spot et série pour les colonies isolées sur une plaque sélective des antibiotiques. Les antibiotiques doivent choisir contre le donneur et pour le receveur contenant le plasmide. Un ou deux stries d'isolement supplémentaires peuvent être nécessaires pour isoler une culture pure.
10. S'assurer que les colonies résultantes sont le symbiote destinataire, et non la souche donneuse, par le dépistage de la présence de phénotypes bénéficiaires spécifiques, tels que la morphologie des colonies, ou la détection réaction en chaîne par polymérase du destinataire des gènes spécifiques. Cribler les colonies de la présence du plasmide par réaction de polymérisation en chaîne d'une séquence connue plasmide et la fluorescence. Les colonies doit fluorescence sous la longueur d'onde correcte correspondant à la protéine fluorescente.

2. Production d'oeufs de nématodes axéniques

1. Croissance de 5 ml du symbiote bactérien naturel du jour au lendemain. Pour commencer une culture, les bactéries peuvent être inoculés dans Lysogénie Broth (LB) ou cu autresmédias lture directement à partir d'un stock ou d'un congélateur plaque de porcelaine.
2. Étaler 600 ul de la culture bactérienne sur 10 mm Agar lipides (LA) plaques ^29. Huit à dix plaques donnera suffisamment de nématodes pour la plupart des espèces.
3. Incuber dans l'obscurité sans humidité à 25 ° C pendant deux jours.
4. Ajouter nématodes infectieux 5.000 mineurs, ou d'autres étapes selon le nématode utilisé, dans 500 ul de médias pour les pelouses bactériennes. Incuber les boîtes à 25 ° C pendant 3 jours.
5. Vérifiez vos plaques pour la présence de nématodes adultes et les œufs. Placer 20 ul d'eau sur une lame de microscope. À l'aide d'un bâton stérile racler en place une petite quantité de nématodes dans le tapis bactérien. Placez le bâton dans l'eau et permettre aux nématodes à nager au large. Regardez votre diapositive à faible grossissement. Pour plus d'informations sur l'apparence reporter à la discussion et à la figure 2.
6. Si les œufs et les femelles sont visibles, continuer, sinon, incuber les plaques à 25 ans & dpar exemple, C et vérifier le bon développement tout hr 6-12. Lorsque les femelles contiennent des oeufs, placez quelques ml d'eau sur la surface des plaques. Remuer doucement les plaques et verser l'eau dans un tube conique de 50 ml. Les nématodes doit se détacher des plaques et ne sera plus visible sur la surface de la plaque. Plusieurs rinçages peut être nécessaire.
7. Permettre aux nématodes de se déposer au fond du tube.
8. Rincer les nématodes. Pipeter l'excès d'eau de la partie supérieure du tube. Remplir avec de l'eau propre et laisser nématodes adultes à régler. Pipeter l'excès d'eau.
9. Remplir les tubes coniques avec une solution d'oeuf. Une fois la solution d'œuf est ajouté le calendrier de toutes les étapes avec une solution d'œuf doit procéder exactement comme décrit pour le rendement maximal d'œufs. Incuber les tubes tout en agitant doucement pendant exactement 10 min. La plupart des nématodes doit être dissous à la fin de l'incubation.
10. Immédiatement centrifuger les tubes coniques à 1250 xg pendant 10 min exactement (ce qui comprend la mise en place de la centrifugeuse afin d'accélérermais pas à 0 x g. Utilisez le frein).
11. Décanter immédiatement le surnageant.
12. Immédiatement remettre en suspension le culot avec une solution d'oeufs par pipetage.
13. Remplir immédiatement tube conique avec une solution d'oeuf et bien mélanger en inversant 3-5 fois. Puis, aussitôt, tourner comme dans 2.10.
14. Décanter immédiatement le surnageant.
15. Remettre en suspension le culot dans du LB à la pipette, transférer dans un tube conique de 15 ml de granulation amélioré au cours des étapes de lavage. LB est la norme pour Steinernema spp. D'autres tampons (par exemple, un milieu minimal sels) peuvent être utilisés en fonction du nématode et la bactérie, en gardant à l'esprit la mémoire tampon ne doit pas nuire soit le nématode ou une bactérie.
16. Remplir le tube avec LB et de spin que dans la version 2.10.
17. Décanter le surnageant et remettre en suspension dans du LB.
18. Rincer les nématodes un total de 3 fois en répétant 2,14 et 2,15.
19. Diluer les œufs de nématodes re-suspendues à un volume approprié. Il devrait y avoir au moins 10 œufs par microlitre. Par exemple,gs peuvent être stockées dans une boîte de Petri 6-cm dans 5 ml de LB pendant au moins quatre jours par adjonction d'antibiotiques pour inhiber la croissance de bactéries colonisant les emballages dans la plaque de parafilm. Les œufs doivent être lavés une fois dans 15 ml de LB (comme dans 2.13 et 2.14) avant d'inoculer sur les pelouses bactériennes. Notez que les œufs éclosent pendant ce temps et ne peuvent pas être synchronisés de développement lorsqu'ils sont utilisés dans des essais de colonisation.

3. Co-culture avec des bactéries fluorescentes Assay

1. Cultiver des bactéries fluorescentes jour au lendemain, la sélection pour le plasmide si nécessaire.
2. Étaler 600 ul de la culture bactérienne sur des plaques de 10 mm lipidiques Agar avec un bâton stérile. Incuber à 25 ° C pendant 2 jours.
3. Lieu 500-5000 œufs de nématodes axéniques sur un total de 100 à 400 pi (2.000 façon optimale les nématodes à 200 pi) sur chaque plaque de gélose lipides.
4. Incuber dans l'obscurité sans humidité à 25 ° C jusqu'à ce que les JI, ou d'autres étapes de l'intérêt, de la forme. JI sera visible comme un fuzzy anneau blanc sur le bord de la plaque. Pour regarder les autres stades de vie, voir Protocole n ° 4.
5. Placer les plaques dans un piège modifiée blanc ^30. Retirez le couvercle de la plaque de gélose lipides et placez le bas dans le fond de quelque 100 vides mm x 20 mm boîte de Petri. Remplissez le grand plat de Pétri avec de l'eau ou autre tampon approprié à votre nématode, pour entourer la petite plaque. Le niveau de l'eau doit être d'environ la moitié de la hauteur de la plaquette.
6. Incuber le piège à eau jusqu'à ce que les JI descendants ont vu le jour dans la mémoire tampon.
7. Nématodes juvéniles infectieux peut être stockée dans l'eau dans un flacon de culture tissulaire.

4. Collection des premiers stades de vie pour le dépistage

1. Utilisez les étapes 3.1 à 3.4 pour mettre en place le dosage.
2. Incuber les plaques jusqu'à ce que les étapes de la vie souhaités sont présents. Daily inspection visuelle peut être nécessaire pour déterminer le moment. Pour inspecter les plaques, utilisez la procédure décrite dans le protocole 2.5. Pour S. carpocapsae X. nematophila sur des plaques de Los Angeles, les femelles gravides seront présents en 4-5 jours, les jeunes seront présents dans 7 jours, et les juvéniles infectieux commencent à être produites par 15-17 jours.
3. Lorsque les étapes de la vie souhaités sont présents, de recueillir votre échantillon. Remplir un puits d'une plaque de 96 puits avec 200 pi de PBS ou un autre tampon approprié. Doucement gratter une partie du tapis bactérien qui contient les nématodes. Une noisette (~ 50 mg) fournira au moins plusieurs centaines de fois nématodes descendance F1 sont produites, mais plus peut être nécessaire pour les points de temps antérieurs. Placer le bâton dans la mémoire tampon et contenant.
4. Incuber pendant 30 secondes à une minute. Retirer le bâton et racler le résidu restant. Utilisez le bâton pour enlever toute la gélose à partir du puits. Les nématodes doivent être visibles dans la zone tampon. Déplacez le mélange tampon dans un tube à centrifuger propre.
5. Traiter les nématodes avec le lévamisole ou un autre agent paralysant. Dissoudre quelques grains de lévamisole dans 30 & mu, L d'eau. Ajouter 1-2 ul de ce mélange pour chaque 50 pi de l'échantillon. Après le traitement lévamisole les nématodes sera pas viable.
6. Si les échantillons seront consultés à une date ultérieure, fixer comme décrit dans cette étape. Si non, passez à l'étape 4.6. Ajouter 200 ul de solution de fixateur contenant un tampon 1X et du paraformaldéhyde 4%. Mélanger doucement pipetage peut causer étapes de la vie délicats à lyser. Couvrir de papier aluminium et laisser incuber à température ambiante sur un agitateur à feu doux pendant au moins 18 heures.
7. Placer les tubes dans un portoir, et permettre aux nématodes de se déposer au fond du tube.
8. Rincer pour éliminer les nématodes arrière-plan. Pipeter l'excès de liquide et ajouter 200 à 500 pi de tampon et mélanger délicatement. Répéter. Ceci peut être répété plusieurs fois pour enlever plus de fond si désiré.
9. Permettre aux nématodes de se déposer au fond du tube et remettre en suspension dans le volume désiré.
10. Si les nématodes ne sont pas fixes, écran immédiatement. Nématodes fixes peuvent être stockés dans le réfrigérateur jusqu'àà deux semaines. A conserver dans l'obscurité.

5. Les nématodes dépistage de l'Association bactérienne par microscopie

1. Sélectionnez certains nématodes à voir à la loupe par prélever un petit échantillon de votre mélange.
2. Afin de s'assurer que les nématodes sont encore pour la photo, traiter avec un agent paralysant, comme décrit dans le protocole 4.5. Si vous ne prenez pas une image ou les nématodes sont déjà fixés, cette étape peut être sautée.
3. Ajouter 20-30 ul de nématodes dans de l'eau à votre lame de microscope et placer une lamelle sur le dessus.
4. Voir les nématodes entiers en utilisant la microscopie optique afin d'assurer les nématodes sont dans le champ de vision.
5. Voir les nématodes à l'aide du paramètre fluorescent sur le microscope qui correspond à la fluorescence exprimée par les bactéries.
6. Pour identifier la localisation bactérienne, prendre des photos du nématode en vertu ambiance lumineuse fluorescente, et un réglage de la microscopie optique, puis superposer les images. Les photos doivent être de la même field de vue. Il peut être nécessaire d'essayer plusieurs grossissements et les vues du nématode à trouver les bactéries.
7. La distribution de la colonisation nématode peut être quantifiée en comptant une population de nématodes, marquant la présence ou l'absence de bactéries, et en calculant le pour cent colonisé. Nous vous recommandons de compter jusqu'à au moins 30 nématodes sein de la population sont comptés dans chaque catégorie (avec ou sans la colonisation) pour obtenir une valeur fiable.
8. Lorsque seulement un peu de nématodes dans la population sont colonisés, il peut être nécessaire de compter plusieurs milliers de nématodes avant le 30 soient respectées. Pour haut débit comptage utilisez les étapes suivantes.
9. Au lieu de compter les nématodes individuellement, aliquote de la population dans une plaque multi-puits (par exemple une plaque de 24 puits). Après les nématodes se sont installés au fond du plat, chaque puits peuvent être numérisés sur le microscope et le nombre de nématodes colonisés ne peut être marqué.
10. Le nombre total de nématodes ipopulation na peuvent être identifiés par des dilutions en série de nématodes dans le puits. Par exemple, 1 ml de nématodes peuvent être ajoutés à un puits, on a bien mélangé par agitation avec une pointe de pipette, et 3 pi peuvent être retirés et comptés pour la quantification de la population totale dans le puits.
11. Le pourcentage de nématodes colonisés peuvent être obtenus en divisant le nombre colonisé par le nombre total de nématodes dans le puits.

6. Les résultats représentatifs

Images au microscope Exemple de nématodes Steinernema associées à des bactéries Xenorhabdus sont présentés dans la figure 3. Pour créer l'image composite vu sur la figure 3A, une image à contraste de phase a été recouverte d'une image fluorescente. La flèche sur la figure 3A indique les bactéries présentes dans le nématode infectieux juvénile (barre = 100 um). Figure 3B a été construit d'une manière similaire et représente un nématode juvénile wie bactéries vertes protéines fluorescentes marquées (barres vertes) localisés à travers la lumière de nématodes intestinaux (barre = 20 mm). Une population de nématodes à partir de deux médias ont été comptés et a marqué à la colonisation par le symbiote bactérien (tableau 1). Pour des statistiques fiables, il est préférable de compter au moins 100 nématodes par échantillon avec au moins 30 correspondant à chaque catégorie. Comme on le voit dans le tableau 1, ces nématodes sont colonisés à un niveau d'environ 14,6% lorsqu'elle est cultivée sur gélose de lipides et 68,6% lorsqu'elle est cultivée sur gélose reins foie. Nématodes et d'autres espèces bactériennes ont été montré pour avoir différents niveaux de colonisation. Par exemple X. nematophila colonise 99% des S. juvéniles infestants carpocapsae (Martens 2003), et P. luminescens colonise 26% des H. juvéniles infestants bacteriophora (Ciche 2003).

Figure 1. Aperçu schématique de la méthode. A. La bactérie est conçu pour exprimer une protéine fluorescente. Œufs de nématodes sont isolés de B. nématodes adultes de produire des nématodes stériles. C. Les nématodes sont stériles co-cultivées avec des bactéries fluorescentes. D. Les étapes de la vie qui en résultent sont vu sous un microscope pour évaluer la présence de bactéries dans le nématode.

Figure 2. Représentation des femmes adultes contenant des oeufs. A. Le schéma montre l'aspect général des femmes Steinernema. En médaillon: l'image d'une CIVD S. feltiae femelle gravide. La flèche noire indique la vulve. Les flèches blanches indiquent les œufs visibles. L'image est à un grossissement de 20x, et la barre d'échelle représente 100 um. B. DIC image d'un point, mais non éclos S.feltiae œuf de nématode. L'image est un grossissement 40X, et la barre d'échelle représente 50 um. C. image DIC d'œufs isolée de S. feltiae nématodes sous un grossissement de 10X. La barre d'échelle est de 100 um.

Figure 3. Exemple d'images au microscope nématodes-bactéries association. A. S. nématodes puntauvense ont été associés à leur symbiote bactérien, X. bovienii, exprimant la GFP. L'image est une image composite produite par superposition d'une image de contraste de phase avec une image fluorescente du même champ de vision. La flèche indique le symbiote fluorescente bactérienne chez l'hôte des nématodes. La barre d'échelle représente 100 um. B. Cette image montre un S. carpocapsae nématodes juvéniles avec exprimant la GFP X. nematophila localisée dans l'intestin des nématodes.Cette image a été construit par superposition d'une image fluorescente sur une image au contraste d'interférence différentielle. La barre d'échelle représente 20 um.

Souche	Nombre de nématodes Avec acteria	Les nématodes total compté	Pour cent des nématodes olonized
S. Agar lipides puntauvense	30	205	14,60%
S. Agar puntauvense Foie Reins	72	105	68,60%

Tableau 1. Exemple de notation d'une population de nématodes pour la présence de bactéries. Dans cette expérience, axénique S. puntauvense nématodes ont été cultivées avec leur exprimant la GFP symbiote sur différents milieux de culture (agar agar et des lipides du foie rein ³²⁾ pour tester les défauts de colonisation. Un total d'au moins un hundrenématodes d par échantillon ont été comptés et marqué pour la présence de bactéries. Pour la puissance statistique, trois expérimental identique doit être compté au moins 30 nématodes correspondant à chaque catégorie.

Tableau 2. Plasmides contenant des protéines fluorescentes. Une liste des plasmides possibles pour l'insertion d'une protéine fluorescente dans le symbiote bactérien est donnée triées par nom de plasmide. D'autres informations sont incluses pour la protéine fluorescente codées, cassette d'antibiotique utilisé pour le maintien du plasmide, d'autres instructions pour l'utilisation, la source du plasmide. La concentration indiquées entre parenthèses est la concentration de l'antibiotique utilisé pour X. nematophila. Chacun de ces plasmides a été utilisé avec succès dans Xenorhabdus soit ou Photorhabdus. Des renseignements supplémentaires peuvent être obtenus à partir des citations relevées. Selonsur la bactérie testée, certains plasmides peuvent ne pas fonctionner sur la base de la protéine fluorescente, le choix des antibiotiques, site d'insertion, ou de l'origine de réplication. Les plasmides mentionnés ci-dessus présentent des caractéristiques différentes qui peuvent permettre l'utilisation de la bactérie d'intérêt. Par exemple, des mini-Tn7-KSGFP insère dans le site attTn7 du chromosome, tandis que les insertions dans le pECM20 X. nematophila chromosome par recombinaison homologue. Alternativement, les plasmides sont maintenus pPROBE extrachromosomique, et chaque pPROBE plasmide a le même squelette et fluorophore mais ont des marqueurs de sélection ou des origines de réplication afin de permettre leur utilisation dans une variété de milieux taxonomiques ou mutantes.

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode pour la détection optique de bactéries dans un hôte de nématodes (Figure 1). Cette méthode tire avantage de la transparence optique des nématodes et la capacité de bactéries étiquettes par fluorescence, permettant l'analyse in vivo des bactéries à l'intérieur de l'hôte de nématodes (Figure 3). Plus précisément, cette approche identifie la localisation bactérienne au sein de son hôte. En comptant une population de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Agar lipides (Stérile)			8 grammes de bouillon de nutriment, 15 grammes d'agar, 5 grammes d'extrait de levure, 890 ml d'eau, 10 ml 0,2 g / ml de MgCl2. 6H 2 0, 96 ml d'une solution de sirop de maïs *, 4 * ml d'huile de maïs Incorporer les médias, tout en versant des plaques * Ajouter ingrédient stérile après autoclavage
Solution de sirop de maïs (Stérile)			7 ml de sirop de maïs, 89 ml d'eau mélange à l'autoclave
Solution Egg			16,6 ml d'hypochlorite de sodium à 12%, 5 ml de KOH 5M, 80 ml d'eau
Lysogénie Bouillon (Stérile)			5 grammes d'extrait de levure, 10 g de tryptone, 5 grammes de sel, 1 L d'eau mélange à l'autoclave
Micro centrifuger	Pêcheur	13-100-675	Toute microcentrifugeuse qui détient microtubes travaillera
Centrifuger	Beckman	366802	Grande centrifugeuse de table qui contient 15 ml et 50 ml tubes coniques
Stérile 60 mm X 15 mm Boîte de Pétri	Pêcheur	0875713
50 tubes à centrifuger ml	Pêcheur	05-539-6
15 tubes à centrifuger ml	Pêcheur	05-531-6
Stérile 100 mm X 20 mm Boîte de Pétri	Pêcheur	0875711Z	Plus profond que des boîtes de Petri standard de
Plaque de 24 puits	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			Le microscope a besoin de capacités fluorescentes compatible avec votre fluorophore
Paraformaldéhyde	Sciences microscopie électronique	15710
PBS (Stérile)			8 g de NaCl 0,2 g de KCl 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 1 L d'eau Ajuster à un pH de 7,4 et d'eau pour 1 L et autoclave
Microtubes	Pêcheur	05-408-138	2 ml ou 1,5 ml tubes
Shaker			Toute agitation que provoque le liquide à déplacer doucement travaillera
L'acide diaminopimélique	Sigma	D-1377	Si nécessaire, compléter des médias à une concentration ou 1 mM