Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l'activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Résumé

Une procédure est décrite pour la manipulation de l'activité du cortex cérébral neurones pyramidaux optogenetically tandis que l'électroencéphalogramme, électromyogramme, et la concentration de lactate cérébral sont surveillés. Enregistrements expérimentaux sont effectués sur les câbles attachés-souris tandis qu'ils subissent spontanément veille / sommeil cycles. Optogenetic matériel est assemblé dans notre laboratoire, le matériel d'enregistrement est disponible dans le commerce.

Résumé

Bien que le cerveau représente moins de 5% de la masse du corps, il utilise environ un quart du glucose utilisé par le corps au repos ^1. La fonction de non sommeil à mouvements oculaires rapides (NREMS), la plus grande partie du sommeil par le temps, est incertain. Cependant, un trait saillant de NREMS est une réduction significative du taux d'utilisation du glucose cérébral par rapport à l'état de veille ^2-4. Ceci et d'autres constatations ont conduit à la croyance largement répandue que le sommeil a une fonction liée au métabolisme cérébral. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la réduction du métabolisme du glucose cérébral pendant NREMS restent à élucider.

Un phénomène lié à NREMS qui pourraient avoir une incidence sur le taux métabolique cérébrale est l'apparition d'ondes lentes, des oscillations à des fréquences de moins de 4 Hz, à l'électroencéphalogramme ^5,6. Ces ondes lentes détectées au niveau de la boîte crânienne ou cérébrale surface corticale refléter laoscillations de neurones sous-jacents entre un état ​​dépolarisé / et un état ​​hyperpolarisé / bas ^7. Pendant l'état bas, les cellules ne subissent pas de potentiels d'action pour des intervalles allant jusqu'à plusieurs millisecondes cents. Restauration des gradients de concentration ionique à la suite de potentiels d'action représente une charge importante du métabolisme de la cellule ^8; absence de potentiels d'action pendant les états associés à la baisse de NREMS peuvent contribuer au métabolisme réduit par rapport à réveiller.

Deux défis techniques ont dû être résolues pour que cette relation hypothétique à tester. Tout d'abord, il était nécessaire de mesurer cérébrale métabolisme glycolytique avec une résolution temporelle reflète la dynamique de l'EEG cérébrale (soit plus de quelques secondes plutôt qu'en quelques minutes). Pour ce faire, nous avons mesuré la concentration de lactate, le produit de la glycolyse aérobie, et donc une lecture de la vitesse du métabolisme du glucose dans le cerveau des souris. Lactate étaitmesurée à l'aide d'un capteur à base de lactate oxydase temps réel incorporée dans le cortex frontal. Le mécanisme de détection comprend une électrode de platine-iridium entouré d'une couche de molécules de lactate oxydase. Métabolisme du lactate par la lactate oxydase produisant du peroxyde d'hydrogène, qui produit un courant dans l'électrode de platine-iridium. Si une montée en puissance de la glycolyse cérébrale permet une augmentation de la concentration en substrat pour la lactate oxydase, qui est ensuite réfléchie en courant accrue à l'électrode de détection. Il était en outre nécessaire de mesurer ces variables tout en manipulant l'excitabilité du cortex cérébral, afin d'isoler cette variable à partir d'autres facettes de NREMS.

Nous avons conçu un système expérimental pour la mesure simultanée de l'activité neuronale par l'intermédiaire du elecetroencephalogram, la mesure du flux glycolytique par l'intermédiaire d'un biocapteur lactate, et la manipulation de l'activité neuronale cérébrale corticale via l'activation de la pyramide optogeneticMidal neurones. Nous avons utilisé ce système pour documenter la relation entre le sommeil liés à des formes d'onde électroencéphalographique et la dynamique moment-à-moment de la concentration de lactate dans le cortex cérébral. Le protocole peut être utile pour toute personne qui s'intéresse à l'étude, à se comporter librement les rongeurs, la relation entre l'activité neuronale mesurée au niveau électroencéphalographique et énergétique cellulaire dans le cerveau.

Protocole

1. Préparation chirurgicale des animaux

1. Sujets expérimentaux

Utilisez la souris de l'B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J lignée transgénique ^9; souche JAX # 7612) ou d'autres souris exprimant le canal cationique sensible à la lumière bleue, channelrhodopsin-2, dans les neurones corticaux cérébraux. Application de la lumière bleue dans le cortex cérébral du B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J lignée transgénique provoque les neurones pyramidaux exprimant channelrhodopsin-2 pour dépolariser et subissent les potentiels d'action ^9,10. À la suite de l'activation des cellules py....

Résultats

Comme le montre la figure 2, une souris équipée pour la stimulation optogenetic et le lactate / EEG / EMG collecte de données a subi spontanées transitions d'état veille / sommeil tout en EEG, EMG et la concentration du lactate cérébral ont été surveillés en permanence. Actuelle au niveau du capteur de lactate augmenté pendant les périodes de faible amplitude EEG et a diminué au cours des périodes de forte amplitude EEG. Comme le montre la figure 3, les deux canaux de.......

Discussion

Les méthodes présentées ici permettent de mesurer la relation entre le sommeil et les changements dans la concentration dans le cerveau du lactate glycolytique intermédiaire sur une échelle de temps n'était pas possible auparavant. Animaux subissent des transitions spontanées entre sillage, NREMS et REMS. En outre, nous sommes en mesure d'appliquer des stimuli optogenetic alors que les animaux subissent ces transitions. Les données recueillies à ce jour montrent que l'impact à la fois spontané et provoqué de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Composant	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
BASi Souris Guide canule	Pinnacle Technology / BASi Inc	7032
Biocapteur lactate	Pinnacle Technology	7004
Montage en tête	Pinnacle Technology	8402
Veille / Système d'enregistrement des biocapteurs	Pinnacle Technology	8400-K1-SL	2 canaux EEG EMG, 1 canal, & 1 biocapteur
Souris captif in vitro kit d'étalonnage	Pinnacle Technology	K1-7000-T
Fibre optique Guide canule	Plastics One	C312G	Grosseur 21 Guide de canule
Canule Dummy	Plastics One	C312DC	21 Dummy Gauge
Scribe fibre de diamant	Thorlabs	S90W
Connecteur de fibre à sertir	Thorlabs	CT042
Tubes furcation	Thorlabs	FT030	03,0 mm
	Thorlabs	T10S13	Dia. 0,012
Décapant Tube furcation	Thorlabs	FTS3
Bare Fiber Revêtement dur multimode	Thorlabs	BFL37-200	200 Diamètre um, 0,37 NA
Fil Cisailles / Kevlar Ciseaux	Thorlabs	T865
Fibre optique époxy	Thorlabs	F112
Outil à dénuder fibre	Thorlabs
Plaque de polissage de verre	Thorlabs	CTG913
Tampon de polissage en caoutchouc	Thorlabs	NRS913
Eye Loupe	Thorlabs	JEL10
Kim Wipes	Thorlabs	KW32
Air comprimé	Thorlabs	CA3
Polissage Puck	Thorlabs	D50-xx
Portée inspection de la fibre	Thorlabs	CL-200
Films de polissage	Thorlabs	LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P
Extrémité du connecteur FC / PC	Thorlabs	30126G2-240	240 Alésage um, SS Ferrule
Unité de stimulation de MC	Multi-Channel Systems	STG-4002
Logiciel de stimulation de MC	Multi-Channel Systems	MC-stimulation V 2.1.5
Blue Laser	CrystaLaser	CL473-050-0
Alimentation Laser	CrystaLaser	CL2005
Fiber Optic Rotary Joint	Doric Lenses	FRJ-v4
			Tableau 2. Matériel et équipements.