La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec l&#39;érythromycine complexe de l&#39;antibiotique A produite par<em&gt; E. coli</em

Résumé

La biosynthèse hétérologue de l'érythromycine A travers E. coli Comprend les étapes suivantes: 1) expérimentales de transfert génétique, 2) la reconstitution hétérologue, et l'analyse du produit 3). Chaque étape sera expliquée dans le contexte de la motivation, le potentiel et les défis dans la production de produits thérapeutiques naturels à l'aide E. coli Comme un hôte de substitution.

Résumé

La production hétérologue de produits naturels complexes est une approche visant à remédier aux limitations actuelles et les possibilités futures. Il est particulièrement utile pour les composés qui possèdent une valeur thérapeutique, mais peut-être pas suffisamment produites ou bénéficieraient d'une forme améliorée de la production. Les procédures expérimentales impliquées peuvent être subdivisés en trois volets: 1) le transfert génétique; 2) la reconstitution hétérologue, et 3) l'analyse du produit. Chaque composante expérimentale est en cours d'optimisation continue pour relever les défis et anticiper les opportunités liées à cette nouvelle approche.

Biosynthèse hétérologue commence par l'identification d'une séquence génétique responsable d'un produit naturel précieux. Le transfert de cette séquence à un hôte hétérologue est compliquée par la complexité voie de biosynthèse responsable de la formation du produit. L'antibiotique érythromycine A est un bon exemple. Vingt gènes (un total de> 50 kb) sont nécessaires pour la biosynthèse éventuelle. En outre, trois de ces gènes codent megasynthases, multi-domaines enzymes chacun 300 ~ kDa dans la taille. Ce matériel génétique doit être conçu et transféré à E. coli pour la biosynthèse reconstitué. Le recours à l'isolement PCR, la construction opéron, multi-cystronic plasmides et électro-transformation sera décrite dans le transfert de l'érythromycine Un cluster génétique de E. coli.

Une fois transféré, l'E. coli cellule doit prendre en charge la biosynthèse éventuelle. Ce processus est également difficile étant donné les différences substantielles entre E. coli et la plupart des hôtes d'origine responsables de la formation produit naturel complexe. La cellule doit fournir des substrats nécessaires pour soutenir la biosynthèse et coordonnée exprimer le cluster génétique transféré à produire des enzymes actives. Dans le cas de l'érythromycine A, la E. coli cellule a dû être conçu pour fournir les deux précurseurs (RPopionyl-CoA et l'acide (2S)-méthylmalonyl-CoA) nécessaire à la biosynthèse. En outre, des modifications de séquences de gènes, le nombre de copies du plasmide, chaperonine co-expression, de modification post-traductionnelle enzymatique, et la température de processus ont également été nécessaire pour permettre à l'érythromycine finale A de formation.

Enfin, la production doit être évaluée avec succès. Pour l'érythromycine A cas, nous présentons deux méthodes. La première est la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) pour confirmer et quantifier la production. La bioactivité de l'érythromycine A seront également confirmés par l'utilisation d'un test biologique dans lequel l'activité antibiotique est testé contre Bacillus subtilis. Les tests d'évaluation établissent la biosynthèse de l'érythromycine A partir de E. coli et préparer le terrain pour les futurs efforts d'ingénierie pour améliorer ou diversifier la production et à la production de nouveaux composés naturels complexes en utilisant cette approche.

Introduction

L'érythromycine est un antibiotique A polykétide produite par le Gram positif bactérie du sol Saccharopolyspora erythraea et la production actuelle a été progressivement améliorée à ~ 10 g / L pendant des décennies de mutagenèse traditionnelle et protocoles de dépistage et, plus récemment, grâce à des programmes d'optimisation des processus ^1-6. Stratégies de mutagenèse et de criblage sont courantes dans le développement de produits antibiotique naturel en raison des difficultés de culture et / ou manipuler génétiquement hôtes de production indigènes et en raison de l'activité antibiotique ou facilement disponibles phénotypes de croiss....

Protocole

Le texte ci-dessous est spécifique de l'antibiotique érythromycine A, mais les étapes sont généralement conçus pour être applicable à d'autres produits naturels comme candidats pour la biosynthèse hétérologue.

1. Érythromycine A Transfert génétique Cluster

1. Conception des amorces de PCR pour amplifier l'ensemble des gènes associés à l'érythromycine Un cluster dans le S. chromosome erythraea. Cette étape est spécifique à ces produits candidats naturels dont le patrimoine génétique des séquences ont été déterminées. Alternativement, les gènes nécessaires peuvent être synthétisés (par le biais de p....

Résultats

Le résultat attendu de cette approche est la production d'un produit entièrement naturel bioactif de l'E. coli hétérologues hôte. Ceci est mieux représenté par les résultats de LC-MS utilisé pour confirmer et quantifier la production (figure 6) et le bio-essai antibactérien utilisé pour confirmer l'activité finale (figure 7). Dans le régime général de la biosynthèse hétérologue, ce résultat définit le succès. Une fois accompli, les efforts de recherche alors se tour.......

Discussion

Les étapes critiques dans la biosynthèse hétérologue sont rencontrés à chacun des trois points de procédure dans le processus: 1) de transfert génétique, analyse des produits et 3), 2) la reconstitution de biosynthèse. Un problème à n'importe quelle étape fera dérailler l'objectif ultime d'établir la biosynthèse hétérologue. Peut-être l'aspect le plus difficile du processus est d'établir la biosynthèse reconstitué, car cela est absolument nécessaire pour permettre une analyse réussie. Toutefois, la r.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Machine à PCR	Eppendorf	Mastercycler personnelle
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Pêcheur	BP231
Electroporateur	BioRad	Micropulser
IPTG	Pêcheur	BP1620
Propionate de sodium	Sigma	P1880
L-arabinose	Sigma	A3256
Agitateur réfrigéré	Thermo Scientific	MaxQ 4000
Micro centrifuger	Eppendorf	Centrifugeuse 5415D
pGro7	Takara	Set escorte plasmide (3340)
pET21, pET28, PCDF Duo-1	EMD Chemicals	69742-3, 69864, 71340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Acétate d'éthyle	Sigma	270989
Méthanol	Sigma	322415
Centrifugeuse à vide	Eppendorf	Concentrateur 5301
Évaporateur rotatif	Buchi	R-200