Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

Résumé

La Drosophila est un réseau cristallin de type composé d'un petit nombre de types de cellules qui sont produites d'une manière stéréotypée ¹. De la perméabilité à l'analyse génétique sophistiquée permet l'étude des programmes complexes de développement. Ce protocole décrit les dissections et immunohistochimie de rétines à trois stades de développement distincts, en mettant l'accent sur la différenciation des photorécepteurs.

Résumé

L'œil composé de Drosophila melanogaster est constitué d'environ 750 ommatidies (yeux unitaires). Chaque ommatidie est composé d'environ 20 cellules, dont les cellules sécrétrices cône lentille, les cellules pigmentaires, une cellule poils et huit photorécepteurs (PR) R1-R8 ^2. Les bénéficiaires principaux ont des structures spécialisées, les microvillosités rhabdomeres, qui contiennent des pigments sensibles à la lumière, les Rhodopsins (ERS). Les rhabdomeres de six PN (R1-R6) forment un trapèze et contiennent Rh1 ^{3 4.} Les rhabdomeres de R7 et R8 sont positionnées en tandem dans le centre du trapèze et partager le même chemin de lumière. R7 et R8 PR stochastique exprimer différentes combinaisons de Rhs en deux sous-types principaux ^5: Dans le sous-type 'p', p RH3 en R7s est couplé avec RH5 en p R8S, alors que dans le sous-type 'y', y Rh4 dans R7s est associée à rh6 en y R8S ^{6 7 8.}

Spécification précoce des PR et le développement des ommatidies commence dans les larves des yeux antennaire disque imaginal, une monocouche de cellules épithéliales. Une onde de différenciation balaie le disque ⁹ et déclenche l'ensemble de cellules indifférenciées en ommatidies ^10-11. R8 La «cellule fondateur est spécifiée en premier et recrute R1-6 et R7 ^12-14. Par la suite, au cours du développement nymphal, la différenciation PR conduit à d'importantes modifications morphologiques ^15, y compris la formation rhabdomere, la synaptogenèse et d'expression finalement rh.

Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes déterminées du développement de la rétine, qui peuvent être appliquées pour traiter une variété de questions concernant la formation de la rétine et les voies de développement. Ici, nous utilisons ces méthodes pour visualiser la différenciation progressive proportionnelle au niveau unicellulaire en tout montage des larves, adultes et midpupal rétines (

Protocole

1. Introduction

Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes de développement définis: le troisième stade larvaire, la midpupal et le stade adulte. Bien que notre protocole fonctionne aussi pour d'autres stades nymphal (pour plus de détails sur les étapes précédentes, voir ^16), nous avons choisi la scène midpupal, comme il est optimal pour l'imagerie tous les PR dans un plan focal et leurs noyaux sont facilement identifiables, ce qui facilite la visualisation des les modèles d'expression de facteurs de transcription. La dissection des rétines fin nymphe....

Discussion

1. Dépannage

D'après notre expérience, les dissections requièrent de la pratique (plusieurs semaines) et sont facilitées par atteindre une position confortable à la main ²¹ par reposer les coudes et les avant-bras sur la table et avec les doigts en contact avec le plat de la dissection. De cette façon, les doigts, les pouces seulement, index et le majeur effectuer des mouvements subtils.

Retrait de la lame sans endommager les photorécepteurs est proba.......

Matériaux

			Réactif
Tampon phosphate salin (PBS1x, pH 7,4)	Sigma		Préparer la solution mère 10x 20. Diluer avec de l'eau distillée pour obtenir PBS 1x et stocker à température ambiante. Laisser refroidir dans la glace avant dissections.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Attention: Irritant Porter des gants. Préparer 50 ml 1xPBS avec 0,3% de Triton X-100 (PBST). Conservez-la à température ambiante.
Solution de formaldéhyde à 37%	Fisher Scientific	F75P1GAL	Attention: toxique, cancérogène probable pour l'homme Porter des gants. Avant l'étape de fixation, fraîchement préparer une solution à 3,7% dans une hotte en diluant avec du PBS, magasin sur la glace.
5% de sérum normal de cheval	Jackson Immuno Research	008-000-001	Préparer 5% v / v de dilution dans du PBST. Conservez-la à quatre degrés.
Les anticorps primaires et secondaires (p. ex âne anti-mouton Alexa Fluor 488, Donkey anti-lapin Alexa Fluor 555, âne anti-souris Alexa Fluor 647)	Les sondes moléculaires Invitrogen	A11015 A31572 A31571	Diluer Anticorps secondaires 1:800 dans du PBST et conserver à quatre degrés.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Diluer à 1:100 dans une solution d'anticorps secondaire.
Réactif Slowfade Antifade Or	Les sondes moléculaires Invitrogen	S36936	Milieu de montage. Conserver à -20 degrés.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	Pour le montage. Préparer 10 ml de dilution à 50% avec de l'eau, magasin distillée à la température ambiante.
CO 2			Pour anesthésier les mouches adultes.
			Équipement
Deux pinces pointues (Dumont # 55)	Outils Fine Science	11255-20
Sylgard 184 Kit élastomère silicone	Dow Corning		Préparer plat dissection Sylgard en remplissant un plat de Petri en plastique avec le mélange Sylgard.
Trois puits plats dissection de verre	Fisher Scientific	21-379
Two broches minuties de dissection (0,1 mm de diamètre) et deux pinholders (12 cm)	Outils Fine Science	26002-10	Insérer une broche de minuties dans chacun des deux pinholders et plier une des repères pour former un crochet.
Lamelles de microscope (22x22-1 et 24x40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Lames de microscope (25x75x1.0 mm; préalablement nettoyé)	Fisher Scientific	12-550-143
Tubes de 1,5 ml microtubes
Effacer vernis à ongles ou du scotch
Agitateur orbital	Bellco
Boîte de support de diapositives	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Pinceau mince
P20 et P200 micropipette et de
Microscope à dissection
Petit seau avec de la glace			Pour refroidir les plaques de verre, ainsi disséquées rétine et les solutions.