Isoler des cellules mélanocytes comme primaires du Cœur de souris

Résumé

Dans ce protocole, w e identifié une nouvelle population de cellules mélanocytes comme (également connu sous le nom mélanocytes cardiaques) dans le cœur des souris et des humains qui contribuent à une arythmie auriculaire déclenche chez la souris.

Résumé

Nous avons identifié une nouvelle population de cellules mélanocytes comme (également connu sous le nom mélanocytes cardiaques) dans le cœur des souris et des humains qui contribuent aux déclencheurs de l'arythmie auriculaire chez la souris. Pour étudier les propriétés électriques et biologiques des mélanocytes cardiaques, nous avons développé une procédure pour les isoler de coeurs de souris que nous avons tirés de celles qui visent à isoler les cardiomyocytes murins néonataux. Afin d'obtenir des mélanocytes cardiaques saines appropriés pour plus vaste patch clamp ou des études biochimiques, nous avons développé une procédure raffinée pour isoler et placage mélanocytes cardiaques basés sur ceux à l'origine conçu pour isoler les mélanocytes cutanés. La procédure est mise en évidence raffiné dans cette revue et produit un plus grand nombre de cellules saines comme des mélanocytes, qui peuvent être étalées en une population pure ou avec des cardiomyocytes.

Introduction

Nous avons récemment identifié une nouvelle population de cellules dans le cœur de souris et les humains qui expriment des enzymes mélanine synthèse et ressemblent morphologiquement mélanocytes cutanés. Nous avons appelé de mélanocytes cardiaques »ces cellules et avons découvert qu'ils sont présents dans des endroits anatomiques dont arythmie auriculaire déclenche proviennent souvent chez l'homme. Nous avons également constaté mélanocytes cardiaques contribuent à des arythmies auriculaires chez la souris avec la suppression de la lignée germinale DCT. Mélanocytes cardiaques sont peu distribués dans l'atrium de la souris où elles contiennent moins de 0,1% de toutes les cellules auriculaires. Pour étudier les propriétés électriques et biologiques des mélanocytes cardiaques, nous avons développé une procédure pour les isoler du cœur de la souris en utilisant des marqueurs spécifiques mélanocytes Cre inductible. Notre procédure initiale a été développé à partir de ceux utilisés pour isoler les cardiomyocytes murins néonataux et donné de très petits nombres de cellules appropriées pour les enregistrements de patch-clamp ou analyse par PCR. Cependant, pour améliorer la guérisone et la viabilité des mélanocytes cardiaques, pour plus d'une analyse en profondeur électrophysiologique ou des études biochimiques, nous avons développé une procédure raffinée de celles qui visent à isoler les mélanocytes cutanés. Le procédé décrit et démontré dans la présente étude a pour avantage de produire des mélanocytes sains cardiaques qui peuvent être étalées en une population pure ou avec des cardiomyocytes.

Protocole

1 Préparation des solutions et des équipements nécessaires

1. Tout d'abord, stériliser les instruments chirurgicaux (pinces droites de forme, pinces de forme incurvée, ciseaux de forme droite et ciseaux de forme incurvée) par les autoclavage pendant 15 min. à 121 ° C. Préparez 2 ensembles d'instruments, où un jeu est utilisé pour disséquer les cœurs et l'autre ensemble sera utilisé pour hacher le tissu.
2. Dissoudre 1 sachet de MCDB153 milieux de culture dans 900 ml d'stérilisé, l'eau filtrée et remuer doucement jusqu'à ce que la poudre soit dissoute. Ajouter du bicarbonate de sodium 1,2 g, soit 15,7 ml d'une solution de bicarbonate de sodium [7,5% p / v], pour chaque litre de volume final du milieu en cours de préparation et agiter jusqu'à dissolution. Ajuster le pH à 7,2 en ajoutant soit du HCl 1 N ou NaOH 1 N, puis versez les médias à travers un filtre de 0,2 um haut de la bouteille dans des conditions stériles dans une hotte de culture tissulaire (enceinte de sécurité biologique). Ramassez ensuite les médias et le stocker à 4 ° C.
3. Préparer les supplémentsajouter au milieu de culture (liste des matières). Les suppléments devraient être ajoutées au milieu juste avant les médias est nécessaire pour l'étalement des cellules.
4. Préparer DPBS avec 10% de FBS, plus des antibiotiques (pénicilline et streptomycine).
5. Ensuite, préparer une solution de trypsine à 0,25% par addition de 0,25 g de trypsine (de pancréas de bovin, l'activité> 2500 unités USP / mg, ultrapure, USB) à 100 ml de DPBS, plus des antibiotiques (pénicilline et streptomycine).
6. Autre équipement requis nécessaire pour effectuer cette procédure comprend une loupe binoculaire, des boîtes de Pétri (10 cm), tubes coniques de 50 ml, crépines de cellules de 40 um, DPBS ainsi que des antibiotiques, des boîtes de culture de 60 mm et des boîtes de culture de 35 mm.

2 Isoler coeurs de néonatalogie chiots de souris

1. Tout d'abord, obtenir P0 à P2 souriceaux nouveau-nés (n = 6 à 8). Il est recommandé d'utiliser les petits générés par l'élevage DCT-Cre femelles homozygotes avec des hommes qui sont hétérozygotes pour soit la R26R: EYFP allèle ou le Z / EG allèle pour marquer lecellules mélanocytes-comme. Les deux R26R: souris EYFP et Z / EG sont disponibles auprès de Jackson Laboratories (nombre d'actions 006 148 003 920 et, respectivement).
2. Ensuite, euthanasier les souriceaux nouveau-nés, essuyer leurs coffres avec un tampon imbibé d'alcool, puis placer les chiots dans une boîte de Pétri 10 cm avec du DPBS.
3. Couper la peau sur la poitrine et le sternum avec une pince et des ciseaux stérilisés puis ouvrir avec précaution la poitrine sous une loupe binoculaire. Les cœurs des souriceaux nouveau-nés sont très petites soyez donc prudent de s'assurer d'enlever le cœur entier avec les oreillettes attachés.
4. Laver les coeurs dans DPBS et de les transférer à une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm.

3 Digestion enzymatique

1. Apportez la boîte de Petri avec les coeurs excisés à une hotte de culture tissulaire (enceinte de sécurité biologique) et puis suivez les étapes ci-dessous en utilisant des techniques stériles dans la hotte.
2. D'abord, lavez les cœurs trois fois dans du DPBS stériles ainsi que des antibiotiques.
3. Placez les coeurs (n = 6-8) dans un60 mm boîte de culture et ajouter 8.6 ml de solution de trypsine à 0,5% dans le plat.
4. Ensuite, coupez le cœur en petits morceaux (moins de 1 mm de diamètre) et incuber à 37 ° C pendant 30 min dans une atmosphère de CO ₂ de 5%.
5. Après la période d'incubation est terminée, verser la solution résultante du tissu cardiaque et de la trypsine à partir de la cuvette dans un tube conique de 50 ml stérile.
6. Ensuite, en utilisant une pipette stérile de 10 ml, rapidement, mais doucement, triturer la solution dans le tube conique de 50 ml 30 à 50 heures.
7. Filtrer la solution résultante à travers un tamis cellulaire de 40 um sur un nouveau tube conique propre, de 50 ml à recueillir le filtrat.
8. Ensuite, centrifuger le tube de 50 ml à 240 x g dans une centrifugeuse de table pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirer délicatement le surnageant et remettre le culot restant dans 6-8 ml de DPBS stériles. Répétez cette étape deux fois plus. Cette étape Granulés les myocytes auriculaires et les mélanocytes cardiaques mais n'apporte pas en bas de la fifibroblastes depuis les fibroblastes sont plus petits et restent dans le surnageant.

Les cellules 4 Placage cardiaque mélanocytes semblables

1. Après la troisième centrifugation, après rinçage, ou bien drainer Aspirer la solution de lavage (DPBS) et remettre en suspension le culot dans 6 ml de milieu de culture MCDB à laquelle les suppléments ont été ajoutés.
2. Maintenant, aspirer la solution concentré en suspension dans une pipette de transfert stérile et placer les cellules dans une boîte de 35 mm, ou dans un puits d'une plaque à 6 puits, et mettre en commun les cellules cardiaques isolées à partir de 3 souriceaux nouveau-nés dans un plat de 35 mm ou bien.
3. Incuber les boîtes de nuit à 37 ° C dans une atmosphère de CO ₂ de 5%, aspirer hors du milieu de culture avec des cellules seules, puis rincer les plaques une fois avec DPBS. Puis ajouter du milieu frais pour les plaques et remplacer les médias tous les 2 jours. Des cellules isolées à partir de cœurs néonataux ou embryonnaires peuvent être maintenues en culture pendant 3 semaines, alors que les cellules isolées à partir entendre adultets peuvent être maintenues en culture pendant 10 jours.

Les cellules 5 isolation cardiaque Melanocyte-comme de Coeur Adulte souris

1. D'abord, enlever le cœur de souris matures (âgés de 3-4 semaines-, n = 3) par une sternotomie ligne médiane après l'administration d'héparine de 100 U par voie intrapéritonéale à des souris, puis de les euthanasier. Il est recommandé d'utiliser du pentobarbital pour euthanasier les souris de cette procédure, mais ce médicament n'est pas disponible dans tous les lieux.
2. Ensuite, laver les cœurs excisés dans DPBS stériles contenant des antibiotiques dans une hotte de culture tissulaire (enceinte de sécurité biologique). Pincez les coeurs légèrement avec une pince de dissection courbes pour retirer toute trace de sang restant d'eux, puis rincez les cœurs dans DPBS une fois de plus.
3. Retirer les oreillettes et anneau auriculo-ventriculaire du cœur (ces structures contiennent les cellules mélanocytes-like) et placer les échantillons de tissus excisés dans un plat de 35 mm.
4. Couper les cœurs en petits morceaux avec des ciseaux courbes et vigueurps, puis ajouter 8.6 ml de solution de trypsine à 0,5% dans le plat. Ensuite, incuber les boîtes à 37 ° C pendant 45 à 60 min.
5. Maintenant, suivez les étapes de la procédure ci-dessus à partir de l'étape 3.6 partir.

Résultats

Le protocole décrit dans cet article est une technique améliorée par rapport à celle que nous avons déjà publié pour isoler les mélanocytes cardiaques du cœur murin. Ce procédé emploie l'utilisation de marqueurs fluorescents entraînés par la synthèse de mélanine spécifique de l'enzyme Cre-recombinase pour marquer les cellules de mélanocytes analogue cardiaques. Il est important d'utiliser un marqueur pour marquer les mélanocytes cardiaques lorsque vous travaillez avec des cellules embryonnaires ou néonatales...

Discussion

Mélanocytes cardiaques sont présents dans des endroits anatomiques dans le cœur qui donnent souvent lieu à des déclencheurs d'arythmie auriculaire. Ces régions comprennent les veines pulmonaires, l'anneau auriculo-ventriculaire, l'oreillette gauche postérieure et le foramen ovale (figure 4). Pour comprendre le rôle de ces cellules jouent dans arythmogénèse, nous développons des techniques de les isoler et d'étudier leur physiologie. Cependant, nous avons constaté que l'amélioration d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Dissoudre dans l'eau
DPBS, sans calcium ni magnésium	Invitrogen	14190136	Conc. stock : 1x Conc. travail : 1x
Pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15140163	Conc. stock : 100x Conc. travail : 1x
Sérum de veau fœtal	Life Technology	Certifié	Conc. travail : 4 %
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	Dissoudre dans le DMSO Conc. stock : 3,2 μM Conc. travail : 32 nM
Transferrine	Sigma-Aldrich	T8158	Dissoudre dans le DPBS Conc. stock : 0,1 mg/ml Conc. travail : 1 μg/ml
AMPc dibutyryle	Sigma-Aldrich	D0627	Dissoudre dans le DPBS Conc. stock : 0,5 mM Conc. travail : 5 μM
Insuline	Sigma-Aldrich	I6634	Dissoudre dans l'acide acétique 10 mM Conc. stock : 1 mg/ml Conc. travail : 5 μg/ml
FGF basique	BD Biosciences	354060	Dissoudre dans l'eau Conc. stock : 4 ng/μl Conc. travail : 4 ng/ml