En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l'évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Résumé

Procédé par lequel l'expression du gène dans le tube neural peut être régulée à la baisse dans une cellule spécifique d'un type, est décrit de façon traçable. Nous montrons comment In ovo des microARN à base de plasmides qui suscitent spatio-temporellement contrôlée ARN interférence peut être utilisée pour étudier le guidage axonal commissurale dans le tube neural développement.

Résumé

Commissuraux EL1 neurones ont été étudiés afin d'élucider les mécanismes qui sous-tendent le guidage axonal pendant ^1,2 développement. Ces neurones sont situés dans la moelle épinière dorsale et envoient leurs axones le long de trajectoires stéréotypées. Axones commissuraux d'abord projeter vers le ventre, puis à travers la plaque de sol. Après avoir traversé la ligne médiane, ces axones faire un virage serré rostrale et le projet longitudinalement vers le cerveau. Chacune de ces étapes est régie par les activités coordonnées de signaux de guidage attractives et répulsives. L'interprétation correcte de ces signaux est essentielle pour guider les axones le long de leur parcours délimité. Ainsi, la contribution d'une molécule physiologique particulier pour le guidage axonal commissure est idéalement étudiée dans le cadre de l'embryon vivant. En conséquence, inactivation génique in vivo doit être contrôlée avec précision afin de bien distinguer les activités de guidage des axones des gènes qui pourraient jouer multiplerôles au cours du développement.

Nous décrivons ici une méthode pour l'expression des gènes effet de choc dans le tube neural de poulet dans une cellule spécifique du type, de façon traçable. Nous utilisons de nouveaux vecteurs plasmidiques ^{3 Hébergement} cellulaires spécifiques au type de promoteurs / amplificateurs qui alimentent l'expression d'un marqueur fluorescent protein, suivie directement par une transcription miR30-RNAi ⁴ (situé au sein de la 3'-UTR de l'ADNc codant pour la protéine fluorescente) ( Figure 1). Lorsque électroporation dans le tube neural en développement, ces vecteurs susciter la régulation négative de l'expression génique efficace et d'exprimer vives protéines marqueurs fluorescents pour permettre le traçage directe des cellules qui connaissent knockdown ^3. Mélanger différents vecteurs d'ARNi avant l'électroporation permet l'effet de choc simultanée de deux ou plusieurs gènes dans les régions indépendantes de la moelle épinière. Cela permet de complexes interactions cellulaires et moléculaires qui seront examinées au cours du développement, d'une manière qui est rapide, smise, précis et peu coûteux. En combinaison avec Dil tracé des trajectoires des axones dans commissurales à livre ouvert préparations ^5, cette méthode est un outil utile pour les études in vivo des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale commissurale et d'orientation. En principe, n'importe quel promoteur / amplificateur peut être utilisé, ce qui pourrait rendre la technique plus largement applicable pour les études in vivo de la fonction des gènes au cours du développement ^6.

Cette vidéo montre d'abord comment manipuler et oeufs de fenêtres, l'injection de plasmides d'ADN dans le tube neural et la procédure d'électroporation. Pour étudier le guidage axonal commissurale, la moelle épinière est enlevée de l'embryon comme une préparation à livre ouvert, fixé, et injecté avec Dil pour permettre voies axonales à tracer. La moelle épinière est monté entre lamelles et visualisées par microscopie confocale.

Protocole

1. Préparation de l'ARNi ADN plasmidique pour Gene Silencing cellulaire spécifique de type

Plasmides (figure 1) sont synthétisés en utilisant des techniques de clonage moléculaire, comme décrit précédemment dans le détail ^3,4.

1.1 Clonage dans les vecteurs: la conception oligonucelotide

1. Nous utilisons les mêmes oligonucléotides et protocoles universels de clonage qui sont décrits dans l'information produit fournie avec le vecteur pRFPRNAiC ⁴ (ARK-génomique).
   1. Pour le clonage dans le site première épingle:
      Amorce 5 'HP1:

Discussion

Cette simple, basée sur un vecteur d'expression artificielle stratégie miRNA peut être utilisé pour l'expression du gène endogène effet de choc dans le tube neural poulet. Ces outils fonctionnels offrent gene silencing multiple, contrôle temporel et une spécificité de type cellulaire, afin de faciliter l'élucidation des voies de développement complexes. En particulier, nous avons démontré l'utilité de ces plasmides dans le guidage axonal commissurale, depuis les plasmides peuvent être utilisés à des gène.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
0,5 mm capillaires en verre	World Precision Instruments	1B120F-4
Verre aiguille extracteur	Narishige	PC-10
Electroporateur	BTX	ECM 830
Sylgard élastomère de silicone	World Precision Instruments	SYLG184
Fil de tungstène, 0,075 mm	World Precision Instruments	TGW0325
Broches d'insectes, 0,20 mm	Outils Fine Science	26002-20
Broches d'insectes, 0,10 mm	Outils Fine Science	26002-10
Ciseaux à ressort	Fin Pour la Scienceols	15003-08
Dumont # 5 forceps	Outils Fine Science	11252-20
Dumont # 55 pince	Outils Fine Science	11255-20
Rapide Dil	Molecular Probes	D-7756
Microscopes à fluorescence	Olympe	SZX12, BX51