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Article de méthode

Occlusion bilatérale de l'artère carotide commune comme un stimulus suffisant pour provoquer le préconditionnement précoce Tolérance ischémique à une ischémie cérébrale focale

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DOI :

10.3791/4387

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9 mai 2013

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1Department of Neurology, Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Germany

Dans cet article

Résumé

Il ya plus de preuves que le préconditionnement ischémique (PC) - un défi ischémique non dommageable pour le cerveau - confère une protection contre les transitoires à un accident ischémique dommageable ultérieure. Nous avons établi bilatérale carotide commune occlusion de l'artère (BCCAO) comme un stimulus de préconditionnement pour induire une tolérance ischémique précoce (IT) à transitoire ischémie cérébrale focale (induite par occlusion de l'artère cérébrale moyenne, MCAO) dans souris C57BL6 / J.

Résumé

Il ya plus de preuves que le préconditionnement ischémique - un défi ischémique non dommageable pour le cerveau - confère une protection contre les transitoires à un accident ischémique dommageable ultérieure. Nous avons établi une occlusion de l'artère carotide commune bilatérale comme un stimulus de préconditionnement pour induire début tolérance ischémique transitoire ischémie cérébrale focale dans souris C57BL6 / J. Dans cette vidéo, nous allons démontrer la méthodologie utilisée pour cette étude.

Introduction

L'AVC ischémique est une maladie avec un taux de mortalité élevé et un énorme fardeau socio-économique 1. Malgré les efforts scientifiques expérimentales et cliniques intensives tout au long des dernières décennies, les options de traitement pour les patients victimes d'AVC ischémiques aigus restent très limitées 2. Contrairement à cela, l'augmentation du pourcentage de personnes âgées dans les pays développés augmentera considérablement l'incidence et de prévalence des patients avec AVC ischémique dans les prochaines décennies 3. Par conséquent, il ya un besoin urgent de nouvelles stratégies de traitement chez les patients ayant subi un AVC ischémique.

Une approche consiste à acquérir une meilleure compréhension des mécanismes d'adaptation endogène du cerveau pour faire face à un stimulus nuisible. Cette neuroprotection dérivé du cerveau est également connu comme le préconditionnement ischémique (PC) ou la tolérance ischémique (IT) et décrit un phénomène dans lequel un stimulus nociceptif non dommageable au niveau du cerveau, induit une résistance transitoirecontre une suite dommageable ischémique insulte 4. Il se produit dans deux fenêtres de temps différents: au début, ce qui se produit en quelques minutes à quelques heures après PC et retardés IT, qui a besoin d'un temps de latence de quelques heures à se produire 4.

Jusqu'à présent, la recherche sur l'informatique dans le cerveau a mis l'accent sur le retarder. On sait beaucoup moins sur les mécanismes de début IT. L'objectif de cette étude est d'établir bilatérale carotide commune occlusion de l'artère (BCCAO) qui est un stimulus mis en place pour l'inciter retardé, comme un PC stimulus suffisant pour induire tôt IT à transitoire ischémie cérébrale focale (induite par occlusion de l'artère cérébrale moyenne, MCAO) dans des souris C57BL6 / J.

Au cours des deux interventions chirurgicales (BCCAO et MCAO), suivi du flux sanguin cérébral (CBF) par laser Doppler (LDF) a été réalisée.

BCCAO a été réalisée chez la souris anesthésiés et respirant spontanément. Les deux artères carotides communes (CCA) ont été exposéset occlusion pendant 60 sec puis 5 min de reperfusion. Cette séquence / reperfusion BCCAO a été répétée deux fois. Après la chirurgie, les souris sont rétablis rapidement et n'ont montré aucun signe d'altération fonctionnelle. Afin d'exclure, que le protocole BCCAO décrit ci-dessus n'a pas abouti à la mort cellulaire retardée dans le cerveau, nous avons réalisé une dUTP-biotine Nick étiquetage fin TdT médiée (TUNEL) coloration 72 heures après BCCAO (ou une intervention chirurgicale fictive) dans un groupe séparé.

MCAO est un modèle largement établi pour l'induction d'une ischémie cérébrale focale chez les rongeurs 5-7. Les interventions chirurgicales ont été réalisées en utilisant des procédures normalisées d'exploitation (SOP) 8. Après avoir exposé gauche CCA, un monofilament silicium recouverte a été introduit dans le CCA distale, avancé par l'artère carotide interne (ACI) dans le polygone de Willis jusqu'à l'artère cérébrale antérieure (ACA) et de ce fait, l'origine de l'artère cérébrale moyenne ( MCA) a été occulté pendant une période de temps définie. Dans cette étude, nousutilisé 45 min de MCAO, ce qui se traduit généralement par une lésion ischémique dans le territoire MCA impliquant les zones du cerveau striatum et cortical.

Dans notre étude, nous avons analysé le profil temporel de début IT utilisant BCCAO que le stimulus de PC. Nos données indiquent que le délai optimal entre BCCAO et MCAO pour induire tôt, il est de 30 min.

Dans cette vidéo, nous allons donner une démonstration de deux interventions chirurgicales, à savoir BCCAO et MCAO.

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Protocole

Toutes les procédures décrites dans cet article ont été réalisées en conformité avec les directives et règlements de l'Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Allemagne.

Procédures pré-opératoires

1. Préparation des monofilaments

  1. Pour la préparation de filaments intraluminale, nylon 8-0 fils de suture de monofilament ont été utilisés et ont été coupées à une longueur de 13 mm chacun.
  2. Pour le revêtement des monofilaments, Xantopren M muqueuse (Heraeus GmbH, Hanau, Allemagne) a été utilisé activée en ajoutant une goutte de solution d'activateur (Activator, universel et, Heraeus GmbH, Hanau, Allemagne).
  3. Le monofilament est lentement tiré à travers le silicone jusqu'à ce qu'elle soit complètement recouverte avec elle. Ce faisant, le monofilament serait uniformément recouvert de silicone. Éviter d'attendre trop longtemps parce que le matériau de revêtement actif deviendra ferme et sèche rapidement.
  4. Avant la silicone commence à se solidifier, Il est recommandé de dépouiller silicone excessive du filament en tirant sur une feuille de papier. Ce faisant, la couche de silicone peut être aminci à une épaisseur d'environ 200 um.
  5. La base du monofilament silicone recouvert était coincé dans la pâte à modeler afin de le laisser sécher pendant la nuit.

Commentaire: Idéalement, seulement stérilisés ou au moins monofilaments désinfectés doivent être utilisés pour assurer la stérilité du site opératoire. Dans la pratique, la stérilisation ou la désinfection des monofilaments fabriqués à la main est très difficile parce que la qualité des monofilaments peut aggraver 9. Par conséquent, il pourrait être préférable d'utiliser des monofilaments stériles disponibles dans le commerce à la place.

2. Préparation des instruments chirurgicaux et des animaux

  1. Tous les instruments chirurgicaux ont été conservées dans 70% d'alcool éthylique. De plus, avant chaque nouvelle intervention chirurgicale, tous les instruments chirurgicaux ont été soigneusement nettoyés unend désinfecté à l'aide de 70% d'alcool éthylique.
  2. La zone chirurgicale a été complètement désinfecté en utilisant 70% d'alcool éthylique dans tous les animaux avant résection. Les sites de désinfectées ont été autorisés à sécher complètement avant d'effectuer les incisions. Clipping supplémentaire de la fourrure n'a pas été effectuée car cela pourrait provoquer microabrasions et l'inflammation de la peau suite 9.

Les interventions chirurgicales

3. Le positionnement de la sonde LDF et de surveillance de FDL

  1. Pour l'induction de l'anesthésie, les souris ont été exposées à un mélange gazeux constitué de 30% d'oxygène, 70% de N 2 O et 2,5% d'isoflurane aide d'un vaporisateur. Pour l'entretien de l'anesthésie, de la concentration d'isoflurane a été réduit à 1,5%. Les souris ont été respirent spontanément via le masque respiratoire durant toute la procédure chirurgicale.
  2. Une sonde de température rectale a été inséré et les souris ont été fixés au châssis stéréotaxique exposer la tête pariétal. Pendant l'opération, les souris ont été posés sur unethermostatée coussin chauffant, en assurant une température de base constante de 37,0 ± 0,5 ° C. Une incision médiane sagittale (~ 1 cm de longueur) a été réalisée pour exposer le crâne pariétal.
  3. Le côté gauche du crâne a été soigneusement disséquée et une sonde à fibre optique a été fixé directement sur le crâne 2 mm caudale et 5 mm latéral du bregma l'aide de colle instantanée. Ensuite, les bords de la plaie ont été soigneusement adaptés pour éviter l'hypothermie cérébrale ainsi que des infections.
  4. La souris a tourné autour d'exposer la face ventrale du cou. La sonde à fibre optique a été relié au dispositif de LDF (PeriFLUX System 5000, Perimed, Järfälla, Suède) via adaptateur de raccordement de la sonde (Master Probe 418-1, Perimed; Järfälla, Suède).

Commentaire: En tournant la souris, la sonde à fibre optique doit être plié avec soin afin d'éviter qu'il se détache du crâne.

  1. Le dispositif LDF a été connecté à un ordinateur portable comordinateur. L'enregistrement en continu des valeurs de FDL a été lancée à l'aide Perisoft pour Windows (Version 2.50, Järfälla, Suède). Figure 1 montre le cours moyen CBF obtenu à partir de dix enregistrements FDL lors BCCAO et la reperfusion.

4. Occlusion bilatérale de l'artère carotide commune

  1. L'anesthésie a été maintenue telle que décrite au point 3.1. Souris a été placée sur son dos. La queue et les pattes de l'animal ont été fixés pour le coussin chauffant avec du ruban adhésif. Une incision médiane ventrale sagittal (~ 1cm de longueur) a été réalisée.
  2. Les deux glandes salivaire ont été soigneusement séparés et se sont mobilisés pour visualiser le sous-jacent de CCA.
  3. Les deux CCA de ont été soigneusement séparés des nerfs vagues respectives et les veines d'accompagnement sans nuire à ces structures. Manipulations des nerfs vagues pourraient conduire à un dysfonctionnement transitoire ou permanente du système nerveux parasympathique, qui a le potentiel pour l'apparition d'arr cardiaque significativehythmia ou même un arrêt cardiaque irréversible. Par conséquent, il est essentiel d'éviter toute manipulation des nerfs vagues. Un lâche soie 5-0 boucle de suture a été faite autour de chaque CCA.
  4. Un petit tube de silicium (diamètre 2 mm) a été inséré entre le CCA et des points de suture en soie de chaque côté. Ce tube a été utilisé comme une attelle de la CCA est en ordre pour éviter d'endommager les parois artérielles lorsque les sutures ont été durcies (figure 4).
  5. Tous deux ont été CCA de occlus pendant une minute en serrant les sutures de soie. Seules les souris, dans lequel le signal LDF a été réduit à <10% du signal de référence ont été inclus dans l'étude. Après la réouverture des deux CCA'S, une période de cinq minutes de reperfusion a été lancé. Par LDF une reperfusion complète a été assurée. Les animaux atteints de reperfusion incomplète (ie récupération <90% de la CBF rapport aux valeurs initiales CBF) ont été exclus. La séquence d'une minute de BCCAO et à cinq minutes de reperfusion a été répétée deux fois pour un total de BCCAO DURATIsur de 3 min. Figure 1 montre l'évolution moyenne CBF obtenu à partir de dix enregistrements FDL lors BCCAO et la reperfusion. Durant la procédure, il est recommandé de garder le cou enroulé humide en utilisant une solution saline normale.
  6. Après la dernière reperfusion, tous les tubes et les sutures ainsi que la sonde à fibre optique fixé au crâne ont été enlevés, les plaies ont été suturées et de la lidocaïne pommade (Xylocain 2%; AstraZeneca GmbH, Wedel, Allemagne) a été appliquée à plusieurs reprises pour les blessures que nécessaire pour gestion analgésique.
  7. Les souris ont été transférés à un pré-chauffé (30 ° C) boîte de récupération (MediHEAT. PecoServives Ltd Brough, Cumbria, Royaume-Uni) jusqu'à ce qu'ils aient repris conscience complète. Par la suite, les souris ont été retournés à leurs cages.

5. Moyen-occlusion de l'artère cérébrale

  1. Les souris ont été re-anesthésié, une sonde de température rectale a été inséré et les souris ont été placé sur un coussin chauffant pour exposer la face ventrale du cou. Ensuite, ils were fixé comme décrit dans la section BCCAO.
  2. Une ligature permanente à l'aide d'une longue 7-0 suture de soie a été faite autour de la CCA proximale gauche et le fil a été tiré doucement caudale à l'aide d'une pince moustique (Figure 4).
  3. Un autre ligature permanente a été faite autour de l'artère carotide externe gauche (CEA) et le fil a été tiré vers le côté droit de l'animal (Figure 4).
  4. Le tissu conjonctif qui entoure la CIA gauche a été soigneusement mobilisé et le nerf hypoglosse a été délicatement soulevé d'obtenir un bon aperçu du cours distale de l'ICA. Les virages ICA gauche vers la gauche tandis que l'artère ptérygopalatine (PPA) suit le cours de l'ICA proximale vers la droite (figure 4).

Commentaire: Il ya une autre artère être identifiés qui tourne à droite en direction caudale. C'est l'artère occipitale, qui provient variable soit à partir de la bifurcation CCA ou de la proximal partie de l'ECA (Figure 4).

  1. Une boucle de suture lâche a été faite autour de l'ICA proximale à l'aide d'un fil de soie 5-0.
  2. En utilisant une petite pince microvasculaire, l'ICA a été temporairement occulté distale à l'5-0 lâche boucle de suture (figure 4).
  3. Une petite incision est faite dans la partie distale du CCA, juste avant la bifurcation CCA aide de ciseaux microvasculaires (figure 4).
  4. A présélectionné monofilament silicone recouvert a été introduit dans le CCA par la petite incision et poussée dans l'ICA jusqu'à ce qu'elle s'arrête à la pince microvasculaire (Figure 4).
  5. Le microCLAMP a été soigneusement retiré de la CIA, tandis que le monofilament a été avancé profondément dans la CIA jusqu'à ce qu'elle s'arrête (Figure 4). Commentaire: En ce moment, retourner la pince dans la main gauche afin que vous ne le tenez pas comme un stylo. Cela permet de saisir le fil avec les pinces plus facilement.La vasculaire pince-applicateur doit être tenu dans la main droite. Il pourrait être nécessaire de serrer de près le lâche 5-0 suture autour de l'ICA afin de prévenir les saignements du côté de l'incision.
  6. L'emplacement exact de la pointe de monofilament a été identifiée pour vérifier si elle a été avancée dans l'ICA et non dans le PPA. Si la pointe de monofilament a été introduit dans le PPA proximal, le filament a été légèrement tiré vers l'arrière, juste avant la bifurcation ICA / PPA. Il a tenté de faire avancer le monofilament dans l'ICA à nouveau, tout en tirant doucement la CIA proximale un peu sur le côté droit. Ce faisant, le cours naturel de l'ACI distale a été simulée qui rend plus facile d'accéder à l'ICA.
  7. Après le monofilament a été avancé dans l'ICA presque complètement, le lâche 5-0 boucle de suture autour de l'ICA proximale a été renforcée afin de maintenir le filament en place. Ensuite, tous les fils de soie ont été raccourcies et la blessure de la peau a été suturée.
  8. La perte de liquide pendant l'intervention chirurgicale a été REPLENished par injection de 1,0 ml de solution saline normale ip Ensuite, la souris a été transféré à la boîte de récupération préchauffé jusqu'à ce qu'il a repris conscience complète.
  9. Pour reperfusion, les souris ont été re-anesthésié et le monofilament a été enlevé après avoir desserré soigneusement la suture de soie 5-0 autour de l'ICA proximal. Ensuite, le 5-0 suture a été resserré à nouveau soigneusement afin de prévenir les saignements.
  10. Après confirmation de l'hémostase complète, la blessure au cou a été suturée.
  11. La lidocaïne pommade a été appliquée à plusieurs reprises localement sur la peau au besoin pour soulager la douleur et de la souris a été transféré à la pré-chauffé (30 ° C) boîte de récupération jusqu'à ce qu'il a repris conscience complète.
  12. Dans un premier indice d'une procédure MCAO succès, une approche indirecte gauche de l'animal a été observé. La sévérité du déficit fonctionnel a été quantifiée en utilisant le score Bederson modifié pour les souris 10. Selon cette note Bederson modifié, les scores neurologiques nousre classés comme suit: 0 (fonction motrice normale), 1 (flexion du tronc et des membres antérieurs controlatéral lorsque la souris a été levée par la queue), 2 (encerclant le côté opposé lorsque la souris a été organisé par la queue sur une surface plane, mais normale posture au repos), 3 (s'appuyant sur le côté contralatéral au repos), et 4 (pas l'activité motrice spontanée ou mort).

6. BCCAO Sham chirurgie

Pour les procédures fictives BCCAO, les souris ont été anesthésiées pour la durée d'une véritable procédure de PC BCCAO, les glandes salivation ont été mobilisés et la CCA ont été exposés de. Il est crucial que les manipulations directes aux artères carotides ou des nerfs vagues sont évités pendant simulacre de procédure. Manipulations de la CCA peuvent endommager sa couche endothéliale, ce qui peut entraîner une libération de composés vasoactifs de l'endothélium ou induire une thrombose locale dans la lumière artérielle. En conséquence, les événements thromboemboliques peuvent survenir après une intervention chirurgicale fictive. Ce serait un facteur de confusion important de the procédure. D'autre part, les manipulations des nerfs vagues pourraient conduire à un dysfonctionnement transitoire ou permanente du système nerveux parasympathique, qui a le potentiel pour l'apparition d'une arythmie cardiaque significative ou un arrêt cardiaque voire irréversible. Par conséquent, il est essentiel d'éviter toute manipulation des nerfs vagues pendant BCCAO.

Procédures post-chirurgicales

7. Infarctus mesures de volume

Pour l'évaluation de la taille du myocarde, les souris ont survécu pendant 72 heures après MCAO. Ensuite, les animaux ont été profondément anesthésié, cerveaux ont été prélevés, congelés dans snap-méthylbutan, sectionnés et colorés avec de l'hématoxyline (en utilisant le protocole Papanicolau) pour les mesures de volume de l'infarctus. Coupes de cerveau ont été prélevés à des intervalles de 600 um et les volumes d'infarctus ont été déterminés en utilisant un analyseur d'image (IAM noyau 7.0 Rev.2.0, GE Healthcare Niagara Inc) et corrigée pour un oedème selon la méthode de Lin et al. 7,11 .

8. Critères d'inclusion

Nous avons inclus les seuls animaux qui présentaient une réduction LDF-CBF mesurée par plus de 90% au cours de chacun des trois épisodes BCCAO. Idéalement, la surveillance LDF devrait être effectuée dans les deux hémisphères cérébraux au cours BCCAO. Pour praticabilité, nous avons effectué la surveillance de FDL seulement dans les hémisphères gauche, qui seront soumis à MCAO plus tard. Cette approche a été décrite avant 6,12. Reperfusion après chaque épisode BCCAO devait être complète (à savoir le retour aux valeurs de base). Pour des raisons de réduction du temps de durée des souris ont été maintenus sous anesthésie, nous n'avons pas surveillons CBF pendant la chirurgie MCAO. Dans une étude pilote avec un groupe distinct des animaux cependant, nous avons suivi CBF par FDL en chirurgie MCAO. Dans ce groupe de souris, nous avons constamment mesuré une réduction de la CBF 90% par rapport à la valeur initiale avant la DPA occlusion. De plus, après le retrait de monofilaments CBF récupéré à> 90% de la respectivevaleurs de base après CCA occlusion. Ces critères de FDL sont établis dans la littérature et le résultat des volumes d'infarctus cohérents 7. Nous n'avons inclus que les animaux qui avaient un score Bederson d'au moins de 1 après la récupération de l'anesthésie après MCAO. En outre, seuls les animaux qui ont survécu pendant 72 heures après MCAO et qui ne montraient aucun signe d'hémorragie intracrânienne ont été inclus dans l'étude.

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Résultats

Notre protocole BCCAO a entraîné des réductions CBF immédiats et profonds (> 90%) lorsque les deux CCA ont été de occlus (Figure 1). Réouverture de la CCA DEL pour compléter reperfusion comme surveillé par FDL (Figure 1). Après PC, les animaux n'ont montré aucun signe d'incapacité fonctionnelle. En outre, il n'y avait pas de mortalité. Coloration TUNEL effectué 72 heures après BCCAO dans un groupe distinct des animaux ne présentaient aucun signe de mort cellulaire retardé...

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Discussion

Dans notre étude, nous avons montré que trois séquences de BCCAO, chacune durant une minute et suivie d'une reperfusion pendant cinq minutes, sont un PC stimulus ischémique suffisante pour induire tôt IT.

En outre, nous avons démontré que le protocole de préconditionnement utilisée est une procédure invasive et sûre mineur sans morbidité postopératoire remarquable, aucun signe d'apoptose dans le cerveau et aucune mortalité. Plusieurs protocoles de préconditionnement ont été décrits p...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à révéler.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope chirurgical binoculaireZeissStemi 2000 C
Source lumineuse pour microscopeZeissSteREO CL 1500 ECO
Plaque chauffante avec sonde rectaleFST21061-10
Châssis stéréotaxiqueDavid KopfModèle 930
CiseauxFST91460-11
Pinces de Dumont n°5FST11251-10
Pinces de Dumont n°7FST11271-30
Pince microvasculaireFST00398-02
Applicateur de pinceFST00072-14
Ciseaux à ressortFST15372-62
Porte-aiguilleFST12010-14
AiguillesFeuerstein, SupramaBER 562-20
Filet de soie 5-0Feuerstein, Suprama
Filet de soie 7-0Feuerstein,Suprama
Filet de soie 8-0Feuerstein, Suprama

Références

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