Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l'aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

Résumé

Les détails article pour le protocole spécifique de site de transfection de siRNA séquence brouillée dans une culture de cellules de mammifères adhérentes à l'aide d'une matrice de micro-électrodes (MEA).

Résumé

La découverte de la voie de RNAi chez les eucaryotes et le développement ultérieur des agents ARNi, comme siRNA et shRNA, ont atteint une méthode puissante pour faire taire des gènes spécifiques ^1-8 pour la génomique fonctionnelle et la thérapeutique. Un défi majeur impliqué dans les études basées sur l'ARNi est la délivrance d'agents ARNi dans les cellules ciblées. Les techniques traditionnelles de livraison non viraux, tels que l'électroporation en vrac et les méthodes de transfection chimiques n'ont souvent pas le contrôle nécessaire spatiale sur la livraison et payer des efficacités de transfection pauvres ^9-12. Les progrès récents dans les méthodes de transfection chimiques tels que les lipides cationiques, les polymères cationiques et les nanoparticules ont donné lieu à des efficacités de transfection hautement améliorées ^13. Toutefois, ces techniques continuent à ne pas offrir un contrôle précis de l'espace au-dessus de livraison qui peut grandement bénéficier miniaturisé technologies à haut débit, des études unicellulaires et les enquêtes sur les interactions cellule-cellule. nt "> Les récents progrès technologiques dans la prestation des gènes ont permis de transfection à haut débit de cellules adhérentes ^14-23, dont une majorité d'utiliser l'électroporation microscopique. électroporation Microscale offre spatio-temporelle précise le contrôle de la livraison (jusqu'à des cellules individuelles) et a été montré d'atteindre des rendements élevés ^{19, 24-26.} De plus, les approches basées sur l'électroporation ne nécessitent pas une longue période d'incubation (environ 4 heures) avec des complexes ADN et de siRNA comme nécessaire dans les méthodes de transfection à base de produits chimiques et de conduire à l'entrée directe de l'ADN nu et siRNA molécules dans le cytoplasme de la cellule. Comme expression d'un gène conséquence peut être atteint dès six heures après la transfection ^27. Notre laboratoire a précédemment démontré que l'utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA) pour le site spécifique de transfection dans des cultures de cellules mammaliennes adhérentes ^17-19. Dans la MEA approche basée sur la livraison de la charge utile génétique est réalisée via localisée à micro-échelle electroporatisur des cellules. Une application de l'impulsion électrique à des électrodes sélectionnées génère locale du champ électrique qui mène à l'électroporation de cellules présentes dans la zone des électrodes stimulées. Le contrôle indépendant des électrodes de commande fournit des micro-spatiale et temporelle au cours de la transfection et permet également de multiples expériences de transfection à base à effectuer sur la même culture qui augmente le débit et la réduction de culture expérimentale à la variabilité culture.

Ici, nous décrivons le dispositif expérimental et le protocole de transfection ciblée des cellules HeLa adhérentes avec une fluorescence marquée brouillés siRNA de séquence en utilisant l'électroporation. Le même protocole peut également être utilisée pour la transfection des vecteurs plasmidiques. En outre, le protocole décrit ici peut être facilement étendu à une variété de lignées cellulaires de mammifères avec des modifications mineures. La disponibilité commerciale de ces accords avec des configurations d'électrodes à la fois prédéfinis et personnalisés font de ce t technique accessiblelaboratoires de recherche avec la plupart des o équipement de culture cellulaire de base.

Protocole

1. Préparation MEA

1. AME pour une utilisation dans des expériences d'électroporation peuvent être fabriqués en utilisant la technique de photolithographie standard comme décrit précédemment ¹⁸ ou acheté directement auprès des fournisseurs des fabricants AME tels que les systèmes multi-canaux (http:/www.multichannelsystems.com/) et Alpha MED scientifique, Inc ( http://www.MED64.com) . Les AME utilisées dans nos expériences ont été fabriqués en interne à l'installation de salle blanche dans l'Arizona State University, qui ....

Discussion

Dans cet article, nous démontrons vidéo de l'utilisation de la MEA pour le site spécifique à la transfection de cellules HeLa avec brouillés séquence de siRNA. Un des avantages de cette technologie est son applicabilité à différentes lignées cellulaires, y compris des lignées de cellules primaires. Notre laboratoire a précédemment démontré que l'utilisation de cette technologie pour le site spécifique à la transfection de culture neuronale hippocampique primaire de rat E18 vieux jour et cellules NIH-3T3 avec bro.......

Matériaux

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Milieux cellulaires: MEM avancée L-glutamine 200 mM Pénicilline / Streptomycine Sérum de veau fœtal	Gibco / Invitrogen HiMedia Laboratories / VWR Lonza Group Ltd Gibco / Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cellule composition des milieux: 2% de FBS, Pennstrep 2% de L-glutamine et 2% à l'avance MEM
Trypsine EDTA	Mediatech, Inc	25 à 053-CL
PBS	Mediatech, Inc	21-040 CV-
Alexa 488 et la rhodamine étiqueté brouillés Sequrence siRNA	Qiagen, Inc	1027292
Tampon d'électroporation	Biorad Laboratories	165-2677
Générateur de signaux	Pragmatique	2414A	Toute forme d'onde / générateur d'impulsions pouvant fournir des impulsions souhaitées peuvent être utilisées.