Ce protocole décrit l'utilisation du peptide: CMH tétramères et les microbilles magnétiques pour isoler des populations de basse fréquence de cellules T spécifiques d'épitopes et les analyser par cytométrie en flux. Cette méthode permet l'étude directe des populations de cellules T endogènes d'intérêt de In vivo Systèmes expérimentaux.
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Article de méthode
Peptide: CMH tétramère basée sur l'enrichissement des cellules T spécifiques d'épitopes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une nécessité fondamentale pour les chercheurs qui étudient l'immunité adaptative avec des modèles expérimentaux in vivo est une capacité à identifier les cellules T en fonction de leur récepteur antigène des cellules T (TCR) spécificité. Nombreuses méthodes indirectes qui sont disponibles dans une population de cellules T en vrac est stimulé in vitro avec un antigène spécifique et spécifiques d'épitope des cellules T sont identifiés au moyen de la mesure d'une réponse fonctionnelle telles que la prolifération, la production de cytokine, ou l'expression de marqueurs d'activation 1. Cependant, ces méthodes seulement d'identifier l'épitope des cellules T spécifiques présentant l'une des nombreuses fonctions possibles, et ils ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter épitope des cellules T spécifiques à des fréquences précurseurs naïfs. Une alternative populaire est le modèle TCR transgénique transfert adoptif, dans lequel les cellules T monoclonaux à partir d'une souris TCR transgénique sont ensemencées dans des hôtes histocompatibles pour créer une population de précurseurs grand nombre de cellules T spécifiques d'épitopes qui peuvent être easily suivi de l'utilisation d'un anticorps marqueur congénique 2,3. Bien que puissante, cette méthode souffre d'artefacts expérimentaux liés à la fréquence non physiologique des cellules T avec une spécificité pour un seul épitope 4,5. En outre, ce système ne peut pas être utilisée pour étudier l'hétérogénéité fonctionnelle des épitopes spécifiques des clones de lymphocytes T au sein d'une population polyclonale.
Le moyen idéal pour étudier l'immunité adaptative devrait impliquer la détection directe de l'épitope des cellules T spécifiques du répertoire des cellules T endogènes en utilisant une méthode qui distingue la spécificité du TCR uniquement par sa liaison au peptide apparenté: CMH (pMHC) complexes. L'utilisation de tétramères pMHC et cytométrie de flux accomplit cette 6, mais il est limité à la détection de populations de haute fréquence de cellules T spécifiques d'épitope ne se trouvent induite par un antigène suivant l'expansion clonale. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode qui coordonne l'utilisation de tétramères pMHC et magnetic technologie d'enrichissement de cellules pour permettre la détection de cellules de fréquence extrêmement basse T spécifiques d'épitope à partir de tissus lymphoïdes de souris 3,7. Avec cette technique, on peut suivre en détail entières populations spécifiques d'épitopes de cellules T endogènes chez la souris à toutes les étapes de la réponse immunitaire.
Protocole
1. Isolement cellulaire à partir des tissus lymphoïdes
- Ajouter 1 ml de glace froide cEHAA (EHAA + 10% de FBS, pénicilline / streptomycine, gentamycine, 2 mM de L-glutamine, 55 mM de 2-mercaptoéthanol) ou tout autre support équivalent des lymphocytes T, une boîte de culture de 60 mm contenant un petit carré de 100 mesh nylon um et le placer sur la glace.
- Euthanasier souris.
- Enlever la rate et les ganglions lymphatiques autant facilement accessibles que possible. Celles-ci doivent comprendre au moins les inguinaux, axillaires, brachiales, les ganglions lymphatiques cervicaux et mésentériques. Placez-les sur le dessus du filet de nylon dans la boîte de culture.
- En utilisant la partie supérieure plate fermé d'un tube de 1,5 ml de centrifugeuse, purée doucement le tissu lymphoïde au cours de la maille de nylon pour libérer les lymphocytes. Ajouter un autre 1 ml de cEHAA et pipette de haut en bas pour travailler les cellules en suspension. Transférer les cellules par un autre morceau de tulle de nylon placé sur la partie supérieure d'un tube de centrifugeuse de 15 ml en polypropylène. Rincer la capsule et mesh avec un autre 1 ml de glace froide cEHAA, poOling les volumes dans le même tube. Répétez l'opération pour obtenir un volume final de cellules suspension de 4 ml.
- Ajouter tampon trieur de froid (PBS + 2% de FBS, azoture de 0,05%) pour un volume final de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C
- Soigneusement aspirer le surnageant, en s'assurant qu'aucun des gouttelettes de liquide sont laissées sur les parois du tube. Remettre en suspension les cellules dans Fc bloc (tampon trieur + 2.4G2 anticorps) culot jusqu'à un volume final d'environ deux fois égale à celle de la pastille elle-même. Par exemple, les rate et ganglions lymphatiques de souris naïves produit généralement une cellule d'environ 100 pi granulés. Dans ce cas, ajouter 100 ul de bloc Fc pour porter le volume à 200 pi. Si un grand degré d'agglutination cellulaire a eu lieu, retirer délicatement la motte de cellules à ce stade avec une pointe de pipette.
2. La coloration tétramère
- Ajouter PE-ou APC-marqué pMHC tétramère à une concentration finale de 10 nM (concentration ou empiriquement optimisé).
- Mix et incubationte pendant 1 heure à température ambiante (ou le temps de manière empirique optimisé et température).
- Ajouter tampon trieur de froid pour un volume de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C Conserver les échantillons sur la glace ou à 4 ° C à partir de maintenant.
- Soigneusement aspirer le surnageant, en s'assurant qu'aucun des gouttelettes de liquide sont laissées sur les parois du tube. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de tri à un volume final de 200 pl. Pour l'enrichissement tétramère double, remettre en suspension dans un volume final de 150 pl.
3. L'enrichissement magnétique
- Ajouter 50 ul de microbilles Miltenyi anti-PE ou anti-APC. Pour l'enrichissement tétramère double, ajouter 50 ul des deux.
- Mélanger et incuber pendant 20 min à 4 ° C.
- Ajouter tampon trieur de froid pour un volume de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C
- En attendant, mettre en place une colonne LS Miltenyi magnétique sur un aimant MidiMACS ou QuadroMACS. Placer un tube à centrifuger ouverte 15 ml en polypropylène sur uneaccumuler directement sous la colonne.
- Ajouter 3 ml de tampon de tri à la tête de la colonne, ce qui lui permet de s'écouler dans le tube de 15 ml.
- Placez un carré de 100 um maille de nylon sur le dessus de la colonne.
- Lorsque les cellules ont terminé la filature, aspirer délicatement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml de tampon trieur.
- Transférer la suspension cellulaire à travers les mailles de nylon sur la tête de la colonne.
- Lorsque la suspension cellulaire a complètement vidé dans la colonne, le tube de rinçage avec une autre origine ml de tampon trieur 3 et transférer le tampon à travers la maille en nylon dans la colonne, le rinçage de la maille dans le processus. Jetez le filet de nylon.
- Lorsque le tampon est vidé complètement dans la colonne, ajouter une autre ml de tampon trieur 3 à la colonne.
- Répétez l'étape 10 pour un total de 3 lavages x 3 ml.
- Supprimez la colonne de l'aimant et la placer sur un nouveau tube de 15 ml en polypropylène centrifugeuse.
- Ajouter 5 ml de tampon trieur à til colonne.
- Immédiatement après, insérer le piston dans le haut de la colonne et dans un mouvement continu, pousser le piston complètement vers le bas, ce qui oblige le tampon sur la colonne dans le tube.
- Centrifuger les tubes contenant la fraction éluée liée et la fraction libre écoulement continu pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C
- Soigneusement aspirer le surnageant de la fraction liée, en s'assurant qu'aucun des gouttelettes de liquide sont laissées sur les parois du tube. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de tri à un volume final de 95 pl exactement. Aspirer et remettre en suspension la fraction non liée à un volume final de 2 ml.
4. Cytométrie en flux
- Pour chaque fraction, enlever et ajouter 5 ul à 200 ul de billes de comptage (ajusté à une concentration de 200.000 / ml dans un tampon de tri) dans un tube de 5 ml FACS. Mettez de côté à 4 ° C pour analyse ultérieure. Pour gagner du temps, les perles peuvent être pré-aliquotés dans des tubes étiquetés avant le début de l'expérience.
- Préparer haster mélange d'anticorps anti-tache sur les marqueurs de surface des cellules (tableau 1). Pour gagner du temps, cela peut être fait avant le début de l'expérience.
- Pour la fraction liée, ajouter une dose de cocktail d'anticorps directement à l'~ 90 pl de cellules dans le tube. Si l'analyse de la fraction libre est souhaité, transférer 90 ul de cellules dans un tube de 5 ml FACS et ajouter une dose de cocktail d'anticorps.
- Mettre en place un panel de commandes de compensation d'une seule couleur pour le cytomètre en flux. Pour chaque fluorochrome à utiliser, mélanger 50 ul de cellules restes fraction libre dans un tube de 5 ml FACS avec 1 pi d'anticorps anti-CD4 conjugué au fluorochrome correspondant. N'oubliez pas de mettre en place un contrôle sans tache aussi.
- Vortex et incuber les échantillons pendant 30 min à 4 ° C.
- Ajouter 5 ml de tampon de tri à chaque tube et centrifuger pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C
- Pour la fraction liée, aspirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de buf trieusefer. Transférer les cellules dans un microtube 1,2 ml FACS. Rincer le tube avec un autre ul de tampon 200 de tri et d'une piscine dans le microtube même. Si amas de cellules sont apparents, passer les cellules à travers un filtre de 50 um.
- Pour la fraction libre et commandes de compensation, décanter ou aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de tampon de tri.
- Mettre en place le cytomètre en flux à l'aide des commandes de compensation d'une seule couleur. Sélectionnez le côté de dispersion de largeur (SSC-W) comme un paramètre supplémentaire doit être enregistré.
- Analyser les échantillons colorés à l'aide d'une séquence de portes d'inclusion successives pour identifier les cellules CD4 + ou CD8 +, comme illustré dans les figures 1 et 2. Pour fractions liées, prélever des cellules autant que possible, jusqu'à un maximum de 2.000.000 d'événements au total. Pour les fractions non liées, collecter des événements 1000000 au total. Gardez le taux d'acquisition ou au dessous de 3000 événements par seconde.
- En utilisant les mêmes paramètres de la machine, l'analyse des échantillons de comptage de perles. Recueillir 10.000 manifestations au total.
- Sauvegardez toutes les données sous forme de fichiers FCS.
5. Analyse des données
- Analyser FCS fichiers de données pour les échantillons de comptage perles en utilisant le logiciel FlowJo. Nuage de points en avant par FITC et mettre une porte promenait dans les billes de comptage (voir les figures 1 et 2). Déterminer le nombre total de compter perles détectés dans chaque échantillon. Soustraire du nombre total d'événements collectées pour déterminer le nombre d'événements cellulaires collectés.
- Calculez le nombre total de toutes les cellules dans chaque échantillon en utilisant les équations décrites dans l'encadré 1.
- Analyser FCS fichiers de données pour les échantillons colorés fraction liée et non liée. Mettre en place une série de portes d'inclusion successives pour identifier + lymphoïde, side-scatter-largeur lo, dump-, CD3 +, CD4 + ou CD8 + tétramère + cellules T dans chaque échantillon comme illustré dans les figures 1 et 2.
- Multiplier le nombre total de cellules dans l'échantillon par les fréquences de chacune des portes d'inclusion utilisés pour définir CD4 + tétramère+ Ou CD8 + tétramère + cellules pour calculer le nombre total de cellules T spécifiques d'épitopes (encadré 1).
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Résultats
La figure 1 illustre représentant parcelles de cytométrie en flux de pMHCII tétramère enrichi la rate et les échantillons de ganglions lymphatiques de souris naïves, tandis que la figure 2 montre des données représentatives pour souris préalablement immunisées avec le peptide pertinent + CFA. Déclenchement de série supprime autofluorescentes et d'autres événements indésirables de l'analyse des CD4 + populations de lymphocytes T. Le CD8 + population de cellules T sert de témoin n...
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Discussion
Le pMHC tétramère méthode basée sur l'enrichissement de cellules présenté par ce protocole est un outil puissant pour étudier épitope des cellules T spécifiques de cellules T endogènes répertoires. L'utilisation de tétramères pMHC permet la détection de cellules T spécifiques d'épitope basé directement sur la capacité de se lier à leurs TCR ligands apparentés pMHC. L'enrichissement fournit un niveau de sensibilité de telle sorte que les populations extrêmement rares de cellules T spécifiques de l'ant...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier André Han Yen-Laurent et de l'assistance technique, et les membres du laboratoire Jenkins de l'aide à l'élaboration de ce protocole.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif Fournisseur | |||
| PE ou APC conjugué pMHC tétramère (ou multimère) | Fabriqué par l'enquêteur, obtenu à partir du noyau NIH tétramère ou achetés auprès de sources commerciales | ||
| Anti-PE conjugués des microbilles magnétiques | Miltenyi | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugués des microbilles magnétiques | Miltenyi | 130-090-855 | |
| Colonnes LS magnétiques | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MidiMACS ou QuadroMACS aimant | Miltenyi | 130-042-302 130-090-976 ou | |
| Perles de comptage de cellules | Life Technologies | PCB-100 |
Références
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Réimpressions et autorisations
