Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Résumé

Cancer fibroblastes associés (CAF) de faciliter l'initiation des tumeurs, la croissance et la progression à travers signalisation qui favorise la prolifération, l'angiogenèse et l'inflammation. Nous décrivons ici une méthode pour isoler des populations pures de fibroblastes normaux et de souris CAF frais et tissus humains par tri cellulaire, en utilisant PDGFRα comme un marqueur de surface.

Résumé

Fibroblastes associés au cancer (CAF) sont le type cellulaire le plus important au sein du stroma tumoral de nombreux cancers, notamment dans les cancers du sein, et leur présence importante est souvent associée à un mauvais pronostic ^1,2. CAF sont une sous-population de fibroblastes du stroma activé, dont beaucoup expriment le marqueur de myofibroblastes α-SMA ^3. CAF proviennent de fibroblastes tissulaires locales ainsi que de la moelle osseuse des cellules dérivées recrutés dans la tumeur en développement et adopter un phénotype CAF sous l'influence du microenvironnement tumoral ^4. CAF a montré une tumeur afin de faciliter l'initiation, la croissance et la progression à travers de signalisation qui favorise la prolifération cellulaire tumorale, l'angiogenèse et l'invasion ^5-8. Nous avons démontré que les CAF améliorer la croissance tumorale par la médiation de l'inflammation tumorale-promotion, en commençant au plus tôt le pré-néoplasiques étapes ^9. En dépit des preuves croissantes des CAF rôle clé que jouent dans la facilitation de la croissance tumorale,CAF étudiant a été un défi permanent en raison de l'absence de marqueurs spécifiques à la CAF et de l'hétérogénéité majorité de ces cellules, avec de nombreux sous-types de co-existantes dans le microenvironnement de la tumeur ^10. Par ailleurs, l'étude de fibroblastes in vitro est entravée par le fait que leur profil d'expression génique est souvent altérée dans ^11,12 culture de tissus. Pour résoudre ce problème et permettre impartiale profil d'expression génique de fibroblastes de souris frais et tissus humains, nous avons développé une méthode basée sur des protocoles antérieurs pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ^13,14. Notre approche repose sur l'utilisation de PDGFRα comme un marqueur de surface à isoler les fibroblastes de souris frais et les tissus humains. PDGFRα est abondamment exprimé par les deux fibroblastes normaux et CAF ^9,15. Cette méthode permet d'isoler des populations pures de fibroblastes normaux et les EFC, y compris, mais sans s'y limiter α-SMA + activé myofibroblastes. Fibroblastes isolés peuvent ensuite êtreutilisé pour la caractérisation et la comparaison de l'évolution de l'expression des gènes qui se produit en cours de tumorigénèse CAF. En effet, nous et d'autres ont rapporté profilage de l'expression des fibroblastes isolés par tri cellulaire ^16. Ce protocole a été réalisé avec succès pour isoler et caractériser les populations hautement enrichies de fibroblastes de la peau des tissus, mammaires, le pancréas et les poumons. De plus, notre méthode permet également de cultiver des cellules triées, afin de réaliser des expériences fonctionnelles et pour éviter toute contamination par des cellules tumorales, ce qui est souvent un obstacle important lorsque vous essayez de CAF culture.

Protocole

1. Dissection du tissu mammaire ou de la peau de souris

1. Avant de disséquer le tissu désiré de souris, préparer les fournitures et réactifs suivants:

   Fournitures:

   • Outils de chirurgie (lavés avec du détergent, puis trempé dans l'éthanol à 70%).
   • Surface de styromousse pour reposer la souris sur lors de la dissection.
   • Épingles ou des aiguilles de tenir des souris lors de la dissection.
   • Bocal en verre avec couvercle pour la digestion, contenant un barreau d'agitation magnétique (autoclave).
   • Bain d'eau à 37 ° C, contenant un agitateur magnétique submersible et suffisamment d&#....

Résultats

PDGFRα utilisant comme marqueur de résultats de fibroblastes dans l'isolement de populations de fibroblastes hautement enrichi tissus. Le niveau de pureté après le tri a été de 99%, telle que quantifiée par l'analyse post-tri (figure 2A). Estimer le pourcentage de contamination des cellules non fibroblastiques par l'expression relative de gènes spécifiques des cellules de contrôle (figure 2B) montre généralement une contamination 0,1-0,6%. Ce niveau de pureté élevé permet pr.......

Discussion

Bien que les expériences réalisées en culture de tissus peut être informatif et proposer des principes fonctionnels qui peuvent être vérifiées in vivo, il est connu que des changements importants se produisent dans l'expression des gènes des cellules en culture ^11,12. Afin d'éviter une étape de culture de tissus lors du profilage d'expression génique dans les fibroblastes, nous avons développé un protocole qui permet l'isolement de la normale, ainsi que des fibroblastes associés au ca.......

Matériaux

70 pm I

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif Société Commentaires (optionnel)
DMEM	Gibco	41965
PBS	Secteurs d'activité biologique	02-023-1A
Collagénase II	Worthington	LS4176
Collagénase IV	Worthington	LS4188
Désoxyribonucléase	Worthington	LS2007
PharmLyse	BD	555899
SPL	93070
Purifié anti-souris CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
Via sonde (7AAD)	E-Bioscience	00-6993-50
Anti-souris CD140a-PE (PDGFRA)	E-Bioscience	12-1401-81
Anti-souris FITC F4/80-	Cederlane	CL8940F
DMEM w / o rouge de phénol	Gibco	31053
BD Biosciences	354236