Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Un indicateur moléculaire de l'adaptation à long terme olfactive dans

10.1K vues

⸱

DOI :

10.3791/4443

⸱

22 décembre 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, 2Fred Hutchinson Cancer Research Center, 3Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une lecture moléculaire adaptation à long terme olfactif Caenorhabditis elegans. La protéine kinase G, EGL-4, est nécessaire pour les mesures d'adaptation stables dans la paire de neurone sensoriel primaire appelé AWC. Pendant de longues odeur d'exposition EGL-4 translocation du cytosol vers le noyau de l'AWC.

Résumé

Lors d'une stimulation soutenue des neurones sensoriels les plus adaptera sa réponse en diminuant leur sensibilité au signal. La réponse d'adaptation permet l'attention de forme et protège également les cellules de la sur-stimulation. L'adaptation dans le circuit olfactif de C. elegans a d'abord été décrit par Colbert et Bargmann 1,2. Ici, les auteurs ont défini les paramètres du paradigme d'adaptation olfactive, dont ils se servaient pour concevoir un crible génétique pour isoler des mutants défectueux dans leur capacité à s'adapter aux odeurs volatiles captées par les cellules Wing Amphid de type C (AWC) des neurones sensoriels. Lorsque de type sauvage C. elegans animaux sont exposés à une jolie AWC-senti l'odeur 3 pour 30 minutes, ils vont adapter leur réactivité à l'odeur et ensuite ignorer l'odeur adaptation dans un essai de chimiotaxie comportement pendant ~ 1 heure. Lorsque de type sauvage C. elegans animaux sont exposés à une jolie AWC-senti l'odeur pendant ~ 1 heure ils seront alors ignorer l'odeur adaptation en achemotaxis analyse comportementale pour ~ 3 h. Ces deux phases d'adaptation olfactive chez C. elegans ont été décrits comme adaptation à court terme olfactif (induite après une exposition de 30 min odeur), et adaptation à long terme olfactif (induite après exposition de 60 min odeur). Des travaux ultérieurs de L'Etoile et al., 4 découvert une protéine kinase G (PKG) a appelé EGL-4 qui est nécessaire à la fois pour l'adaptation à court terme et à long terme dans les neurones olfactifs AWC. La EGL-4 protéine contient une séquence de localisation nucléaire qui est nécessaire à long terme des mesures d'adaptation olfactifs, mais dispensable à court terme des mesures d'adaptation olfactifs dans les 4 AWC. Par le marquage EGL-4 avec une protéine fluorescente verte, il était possible de visualiser la localisation de EGL-4 dans l'AWC lors d'une exposition prolongée odeur. L'utilisation de ce entièrement fonctionnel GFP-étiqueté EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécule que nous avons pu développer une lecture moléculaire adaptation à long terme olfactive dans les 5 AWC. L'utilisation de ce mlecture olecular d'adaptation olfactive, nous avons été en mesure d'effectuer les deux écrans avant et arrière génétiques pour identifier les animaux mutants qui présentent des modèles défectueux localisation subcellulaire de la GFP :: EGL-4 dans l'6,7 AWC. Nous décrivons ici: 1) la construction de la GFP :: EGL-4 animaux exprimant; 2) le protocole pour la culture des animaux à long terme analyses de translocation induite par l'odeur nucléaires, et 3) la notation de long terme induite par l'odeur Si la translocation nucléaire et la récupération (re-sensibilisation) de la GFP nucléaire :: EGL-4 Etat.

Protocole

1. Construction de la GFP Tagged EGL-4 animaux exprimant

  1. Cloner la fusion traductionnelle GFP :: EGL-4 sous le promoteur pour le gène odr-3 (2678 pb utilisation directement en amont du codon d'initiation): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. L'expression ODR-3 disques de promoteur dans les paires de neurones amphid: AWA, AWB, AWC, et faiblement dans l'ASH.
  2. Injecter le plasmide (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 de type sauvage dans (N2) animaux à 50 ng / ul avec les marqueurs de co-injection en utilisant des techniques de transformation de la lignée germinale 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / pl) et (p) odr-1 :: dsRED 10 (25 ng / pl). Le odr-1 promoteur dirige l'expression dans l'AWC et AWB amphid paires de neurones, et la ofm-1 promoteur dirige l'expression dans les coelomocytes.
  3. Soumettre les animaux transgéniques exprimant les tableaux détaillés extrachromosomiques à l'étape 1.2 de l'ultra-violet (UV) / triméthylpsoralène (TMP) protocole d'intégration11.
  4. Bleach synchroniser les 12 animaux et de les cultiver sur des nématodes croissance des médias (NGM) des plaques contenant OP50 E. coli à la phase de L4. Lavez-L4 animaux assiettes NGM avec M9 tampon pour éliminer OP50 E. coli.
  5. Éliminer le tampon M9 et ajouter 50-100 ul de 30 pg / ml solution TMP travail sur le culot à vis sans fin dans le tube de 1,5 ml. Enroulez le tube de 1,5 ml dans du papier pour bloquer la lumière ambiante et agiter doucement sur un agitateur pendant 15 min dans la feuille gainé de tube de 1,5 ml. Transfert vers dans la solution TMP / ver sur une plaque non ensemencée NGM grande.
  6. Exposer les vers sur la plaque NGM aux UV 350 pJ (X100) à l'aide de 2400 Stratalinker. Ensuite, ajoutez les vers à une plaque OP50 NGM contenant et laisser incuber dans l'obscurité pendant 5 heures.
  7. Choisissez 50 vers transgéniques à environ 10 plaques ensemencées (2-5 vers chaque plaque). Transfert P0 est à chaque nouvelles plaques de 24 h pendant 3 jours.
  8. Choisissez une 250 F1 clonalenimals (1 animal par plaque). Cloner 2-4 animaux F2 de chaque plaque F1. Vérifiez animaux F3 pour rechercher une ligne de transmission de 100% en consultant d'(p) ofm-1 :: GFP modèle d'expression sous une loupe binoculaire fluorescent.
  9. Outcross la dernière ligne intégrée (s) avec les animaux de type sauvage N2 5 fois. Nous nous référerons à la dernière ligne intégrée pyIs500, et la GFP-étiqueté EGL-4 molécule GFP :: EGL-4.

2. La culture et l'entretien des animaux d'analyses de translocation nucléaire

  1. Cultiver les animaux pyIs500 à 25 ° C sur des plaques standard de 10 cm NGM (voir ci-dessous pour la recette) ensemencé avec OP50 E. coli 13 (figure 1).
  2. Le jour 1, ramasser quatre à cinq L4 pyIs500 animaux de plaques cultivées à 25 ° C sur cinq différentes 10 cm OP50 E. coli ensemencées plaques et incuber à 25 ° C (c'est, 4-5 L4 animaux par plaque).
  3. Le jour 4, lavez adulte populations de pyIs500 animaux hors des plaques NGM volumineux à l'aide de S-basale tampon (voir ci-dessous pour la recette). Utiliser des pipettes en verre à usage unique pour transférer les animaux, car ils adhérer à la paroi de pointes de pipettes en plastique.

3. À long terme Odeur induite analyses translocation nucléaire

  1. Laver les animaux pyIs500 3 fois dans S-basale pour éliminer les bactéries. Ne pas centrifuger les animaux entre les lavages, mais plutôt permettre aux animaux de se déposer par gravité dans un stationnaire tube de 1,5 ml. Il est essentiel de s'assurer que toutes les bactéries est retiré, et que les pâtés NGM sont exempts de contamination, car les bactéries résiduelles affectera négativement le résultat du test de translocation. En outre, nous avons constaté que l'autoclave de 1,5 ml microtubes produit un "collant" bien sur les parois intérieures du tube qui entraîne les animaux à coller aux parois, et ainsi utiliser non autoclavé tubes de 1,5 ml microtubes.
  2. Alors que les animaux s'installent entre les lavages, maquillage til adaptation solution. Ajouter 100 ml de S-basale tampon pour un cylindre de 100 ml diplômés. Ajouter adapter l'odeur de la S-basale et scelle le cylindre à l'aide d'une bande de parafilm. Si vous effectuez l'adaptation benzaldéhyde ajouter 7,5 ul de benzaldéhyde dans 100 ml de S-basale, d'adaptation butanone ajouter 11 ul de 2-butaone à 100 ml de S-basale. Retourner doucement (ne pas secouer) le cylindre contenant diplôme S-basales et les odeurs 30 fois pour créer une émulsion uniforme.
  3. Après le lavage final dans S-basale, permettre aux animaux de se déposer et retirer tout le liquide. Une étiquette tube "+ ve" ou "adapter" et l'autre tube "-ve" ou "unadapt". Puis ajouter 1 ml du mélange adaptation au microtube adaptation (+ ve) et ajouter 1 ml de S-basale de la microtube de contrôle inadapté (-ve). Essayer de maintenir le nombre d'animaux entre 100 et 200 dans chaque tube. Avec un peu de pratique, il est possible d'estimer le nombre approximatif d'animaux dans une pastille à l'oeil.
  4. Placer un tube de 1,5 ml capuchon protecteurdans chaque tube (empêche les couvercles de popping ouvert) et placer les tubes sur un agitateur pendant 80 min. Nous avons trouvé que l'exposition odeur entre 60 min et 80 min donne des résultats similaires (à la fois en raison des mesures d'adaptation à long terme). Cependant, 80 min exposition fournit des résultats plus cohérents dans nos mains. Ainsi, tous nos essais d'adaptation à long terme sont normalisés en utilisant une exposition odeur min 80 (figure 2).
  5. Après 80 min, laver les animaux 3 fois en S-basale. Permettre aux animaux de se déposer par gravité entre chaque lavage.

4. À court terme induits par l'odeur analyses de translocation nucléaire

  1. Dans le cas de l'adaptation odeur de courte durée, utiliser le même protocole que par des essais à long terme translocation odeurs provoquées par étapes (3.1-3.4), mais au lieu d'incubation des animaux à s'adapter pyIs500 odeur pendant 80 minutes, utilisez une exposition de 30 min . La quantification des odeurs provoquées par des tests de translocation nucléaire décrites ci-dessous (étape 5) est le même à long terme et à court terexpositions m.

5. Notation de l'événement odeur induite par translocation nucléaire

  1. Faire 2% d'agarose contenant des plaquettes de 5 mM d'azoture de sodium (NaN 3) en dissolvant dans l'électrophorèse sur gel d'agarose 2 0 dH. Placez une seule goutte d'agarose fondu contenant NaN 3 sur une lame de microscope en verre. Placer immédiatement une autre lame de microscope en verre sur la première diapositive pour aplatir la goutte d'agarose fondu. Laissez-le pendant 30 secondes, puis doucement démêler le microscope glisse en laissant une lame de microscope avec une semelle d'agarose de ~ 1 mm.
  2. Après le lavage final dans S-basale, permettre aux vers de terre pour s'installer dans le tube de 1,5 ml et éliminer tout le liquide. Ensuite, ajoutez les animaux goutte à goutte sur les plages d'agarose de plusieurs lames de microscope. Il est important de garder le nombre d'animaux par lame entre 50 et 100. Trop d'animaux par lame va compliquer la notation et créent souvent une lueur bleu-après disperser la lumière d'excitation. L'excès de liquide peutêtre méchant du tampon d'agarose en utilisant un petit Kim-wipe. Placez un verre 0,5 mm lamelle sur le tampon et laisser reposer pendant 2 minutes pour permettre le NaN 3 à immobiliser les animaux. Remarque, les animaux peuvent être récupérés à partir des diapositives après avoir marqué. Les animaux se remettre de l'anesthésie NaN 3 après ~ 1 h en cas de transfert d'une plaque ensemencée NGM dans une goutte de tampon M9.
  3. A ce stade, il est impératif que chaque expérimentateur élaborer une clé de suivre coulissant est l'expérimental (+ ve) coulissant et qui glissent est le contrôle (-ve) coulissant, et passer les diapositives à une autre personne qui aveuglément marquer la GFP: EGL-4 modèle de localisation. Ceci permet de contrôler les biais de l'expérimentateur.
  4. Score entre 50 et 100 animaux par lame à l'aide d'un microscope droit fluorescent avec objectifs à fort grossissement 10X, 40X et 63X et GFP / RFP filtres. Tout d'abord, localiser les animaux sous un grossissement 10X en utilisant éclairage sur fond clair. Ensuite, localisez le neurone AWC en éteignant l'bright-champ d'éclairage et en utilisant le filtre DP. Les (p) odr-1 :: lecteurs dsRED expression dans les neurones et AWB AWC. Les neurones ont AWC distinctifs ovales en forme de corps cellulaires par rapport aux corps cellulaires AWB qui sont plus petits et de forme circulaire (figure 2).
  5. Une fois que le corps de la cellule AWC a été localisé, passer au filtre GFP et d'enregistrer la localisation de la GFP: EGL-4 comme le nucléaire ou cytoplasmique. En utilisant un compteur permet à l'expérimentateur de garder regarder dans l'oculaire tout en marquant la diapositive. Note: 5.1 à 5.5 étapes sont répétées au moins 3 fois à des jours différents pour produire des données statistiquement significatives (figures 1-2).

6. Surveillance GFP-étiqueté EGL-4 lors de la récupération de l'adaptation odeur à long terme

  1. Après l'étape 3.5, diviser les populations d'animaux pyIs500 en aliquotes multiples et notes pour la GFP nucléaire par rapport cytoplasmique :: EGL-4 dans l'AWC à zéro point dans le temps (c'est-à-après 80 min d'exposition) et multiples points de temps ultérieurs (figure 3).
  2. Transfert à la fois le contrôle (-ve) et expérimentales (+ ve) animaux utilisant des pipettes en verre jetables sur des plaques NGM.
  3. Permettre aux animaux de récupérer pour différentes longueurs de temps et de réexaminer la localisation de la GFP :: EGL-4in AWC à chaque point dans le temps comme dans les étapes 5.1 à 5.5.

7. Matériels

Plaques NGM: Pour ajouter 1 L à 1 L ddH 2 0: 21 g de Bacto-Agar, 3 g Chlorure de sodium (NaCl), 2,5 g de Bacto-peptone. Médias autoclave. Après autoclavage, refroidir la gélose jusqu'à ce que la température indique 54 ° C Ajouter les solutions suivantes: 25 ml de tampon phosphate de potassium 1M, 1 ml 1 M Sulfate de magnésium (MgSO 4), 1 ml chlorure de calcium 1 M (CaCl 2); 1 Cholestérol ml dans de l'éthanol (5 mg / ml).

1 M dibasique K 2 HPO 4 174,2 g / mol: 500 ml Pour: Dans 400 ml ddH O 2, dissoudre 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Réglez le volume à 500 L avec ddH 2 O. Stériliser par filtration à l'aide d'une unité de 500 ml stérile filtre.

1 M monobasique KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Pour 1 L: Dans 800 ml ddH O 2, dissoudre 136,1 g monobasique KH 2 PO 4. Réglez le volume à 1 L avec ddH 2 O. Stériliser par filtration à l'aide d'une unité de 500 ml stérile filtre.

1 M de phosphate de potassium (K 3 PO 4) pH 6,0 Tampon: Pour 1 L: Dans un 1 L Unité de filtration stérile, ajouter 868 ml de 1 M monobasique KH 2 PO 4. Laissez l'appareil à filtrer à travers, puis ajouter ml 132 de 1 M dibasique K 2 HPO 4. Laissez l'appareil pour filtrer tout le liquide. Retirez l'unité de filtre et ajuster le pH à 6,0. Conservez-la à température ambiante.

S-basale: Pour 1 litre: ajouter 50 ml 1M K 3 PO 4 tampon, pH ~ 6,0, et 20 ml de NaCl 5M aq. Remplir à 1 L avecddH 2 O. Solution autoclave.

M9: Pour 1 litre: 3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Remplir à 1 L avec ddH 2 0. Stériliser à l'autoclave.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Un exemple de modèle de localisation de la GFP :: EGL-4in l'AWC avant et après exposition prolongée odeur est montré dans la figure 2. Avant l'exposition prolongée odeur, la GFP :: EGL-4 est localisée dans le cytosol de la AWC (figure 2B), et après 80 min d'exposition odeur GFP :: EGL-4 est localisée dans le noyau de l'AWC (figure 2D). Au niveau comportemental, les animaux avec cytosolique GFP :: EGL-4 dans AWC sont attirés par une source ponctuelle de l...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L'entrée des odeurs nucléaire induite d'une GFP-étiqueté EGL-4 molécule décrite ici fournit une lecture solide moléculaire de l'adaptation olfactive chez C. elegans. Les analyses des odeurs provoquées par translocation nucléaire sont simples et ne nécessitent que quelques jours de temps de préparation. L'animal pyIs500 que nous avons construit pour ces essais, exprime un marqueur qui illumine le neurone AWC ainsi que l'expression de la GFP-étiqueté EGL-4 protéines. Ainsi, nous estim...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Nous tenons à remercier Scott Hamilton, et des membres du laboratoire O'Halloran la lecture attentive de ce manuscrit. Nous remercions également notre relecteur anonyme pour d'excellentes suggestions et commentaires pertinents.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
Bacto Agar Difco DF0140-07-4 Plaques NGM
Chlorure de sodium Fisher Chemical S671-10 Plaques NGM
Bacto Peptone Difco DF0118-07-2 Plaques NGM
Phosphate de potassium dibasique Fisher Chemical S375-500 S-basale tampon et plaques NGM
Phosphate de potassium monobasique Fisher Chemical P285-500 S-basale tampon et plaques NGM
Kimwipes - Petit Kimberly-Clark LS2770
L'éthanol à 100% Shield Gold chimiqueCie. 43196-115 les odeurs de dilution pour les essais de chimiotaxie
Chlorure de calcium Sigma-Aldrich C8106-500G Plaques NGM
Sulfate de Magnésium MP Biomédical 150136-500G Plaques NGM
D'azoture de sodium à 99% Fisher Scientific ICN10289180 Anesthésique
Agarose - UltraPure Invitrogen 16500-500 Coussinets d'agarose
Benzaldéhyde Sigma-Aldrich B1334-100G Odeur AWC
Butanone, ACS grade Sigma-Aldrich 360473-500ML Odeur AWC
Microtubes à centrifuger - 1,5 ml de couleur Denville LS8147
Pipette Pasteur en verre jetable 5-3/4 " Fisher Scientific 13-678-20B
Stratalinker Stratagene Stratalinker 2400 L'intégration UV
Bouteille vide Filter - 500 ml Nalgene 09 à 740-25B

Références

  1. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803(1995).
  2. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).
  3. Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515(1993).
  4. L'Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
  5. Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016(2010).
  6. O'Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).
  7. O'Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).
  8. Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
  9. Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314(1999).
  10. L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575(2000).
  11. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451(1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
  13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71(1974).
  14. Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).
  15. Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835(2008).
  16. Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Neurones AWCmarquage GFPprot ine kinase Gtranslocation nucl aireessai de chimiotactismeadaptation long termecriblage g n tiqueplasticit des neurones sensoriels
Un indicateur moléculaire de l'adaptation à long terme olfactive dans
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.