Les explants blastomères à l'essai pour l'engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Résumé

Le destin d'une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L'utilisation de cartes sort de l'embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

Résumé

Cartes Destin, construits à partir de la lignée de traçage de toutes les cellules d'un embryon, qui révèlent les tissus descendent de chaque cellule de l'embryon. Bien que les cartes destin sont très utiles pour identifier les précurseurs d'un organe et pour élucider la voie de développement par lequel les cellules descendants peuplent cet organe dans l'embryon normal, ils n'illustrent pas le plein potentiel de développement d'une cellule précurseur ou d'identifier les mécanismes par lesquels son sort est déterminé. Pour tester la volonté du destin cellulaire, on compare répertoire normal d'une cellule de descendants dans l'embryon intact (la carte sort) avec ceux qui sont exprimés après une manipulation expérimentale. Est le destin de la cellule fixe (engagé), indépendamment de l'environnement cellulaire, ou est-elle influencée par des facteurs externes fournis par ses voisins? En utilisant les cartes complètes sort de l'embryon de Xenopus, nous décrivons comment identifier, d'isoler et de culture simples précurseurs stade de division, appelée blastomeres. Cette approche permet d'évaluer si ces premières cellules se sont engagés à le devenir qu'ils acquièrent dans leur environnement normal de l'embryon intact, nécessitent des interactions avec leurs cellules voisines, ou peut être influencée à exprimer destins alternatifs s'ils sont exposés à d'autres types de signaux.

Introduction

Xenopus laevis embryons ont été utilisés à grande échelle pour identifier les mécanismes par lesquels les cellules embryonnaires acquérir leurs destins particuliers parce que leurs œufs sont assez grands pour permettre des approches de microchirurgie. En outre, ils développent l'extérieur sans la nécessité d'une supplémentation nutritionnelle du milieu de culture, parce que chaque cellule contient une alimentation riche intracellulaire de plaquettes vitellines qui fournissent un accumulateur d'énergie intrinsèque. Un atout important pour l'étude des mécanismes par lesquels le destin des cellules est déterminée est l'ensemble complet de cartes sort des blastomères stade de division (à partir de 2 - à 32 cellules étapes) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Ces cartes ont été construits par micro-injection d'une molécule détectable en un seul blastomère identifiables et suivi plus tard dans le développement de tissus qui sont peuplées par les descendants étiquetés. Les cartes compatibles sont destin possible parce que les axes cardinaux des embryons peuvent être identifiés de façon fiable dans de nombreux embryos. Tout d'abord, dans tous les embryons de type sauvage de l'hémisphère animal est pigmenté, alors que l'hémisphère végétatif est pas. Deuxièmement, l'entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation provoque une contraction de la pigmentation hémisphère animal vers le côté ventral avenir, dans de nombreux embryons une différence de pigmentation peuvent donc être utilisés pour discriminer entre les côtés dorsal et ventral. En troisième lieu, le premier sillon de clivage se rapproche du plan médian sagittal dans la plupart des embryons, et peut donc être utilisée pour identifier les bords droit et gauche de l'embryon. Les cartes sort aussi compter sur le fait que, naturellement, les oeufs fécondés fréquemment fendra par des motifs réguliers qui font que chaque blastomère identifiable à travers une large population d'embryons. Alors il existe une variabilité au sein et entre les couvées d'œufs sur des patrons de pigmentation et le décolleté, en utilisant les procédures de sélection décrite ici permet cellules avec des destins prescrites pour être identifié avec environ 90% de précision.

Destins cellulaires peuvent être dissuader lesextrait au cours de l'embryogenèse par plusieurs mécanismes. Les facteurs intrinsèques, tels que différemment héritées des ARNm cytoplasmiques ou des protéines, contribuent à plusieurs aspects de la structuration précoce. Par exemple, certains ARNm maternels déterminer les cellules qui contribuent à la lignée germinale, devenu l'endoderme, ou de contribuer à l'axe du corps dorsale (pour revue ^7). Les facteurs extrinsèques fournis localement par les cellules voisines ou plus lointainement à partir d'un centre embryonnaire de signalisation, sont responsables de l'induction types spécifiques de tissus et de motifs presque tous les systèmes d'organes. Exemples de centres de signalisation incluent l'organisateur / noeud dans la gastrula qui induit l'ectoderme neural et les modèles du mésoderme, et la zone d'activité polarisante que les modèles de l'axe antéro-postérieur du bourgeon de membre. Bien que les cartes destin d'identifier les précurseurs des différents organes et de révéler la voie du développement pris par leurs descendants dans l'embryon normal, ils ne peuvent pas distinguer intrinsèqueet les influences extrinsèques sur ces cellules. Ils ont également ne pas révéler le plein potentiel de développement d'une cellule, dont les descendants se différencier dans l'environnement complexe de signalisation de l'embryon. Deux approches expérimentales pouvez tester si le destin d'une cellule est déterminée par des facteurs intrinsèques ou est ensuite influencée par des facteurs externes: 1) la transplantation de la cellule à un emplacement roman dans l'embryon, ou 2) la suppression de la cellule de l'embryon suivie par la culture dans l'absence de signaux exogènes.

Les deux approches expérimentales ont été faisable chez Xenopus parce que les cellules sont assez grands pour être séparé manuellement. Par exemple, de nombreuses études ont supprimé des cellules individuelles à partir d'embryons (pour changer interactions cellule-cellule) ou des cellules transplantées à des endroits nouveaux dans les embryons d'accueil pour tester les modifications sort (commentaire en ^{7, 8, 9).} En outre, la seconde approche de l'explantation de petits nombres de cellules de différentes régions de l'embryon iculture nto d'élucider les interactions inductives tissulaires en l'absence de facteurs exogènes est possible parce que les cellules de l'embryon de Xenopus sont remplis d'un magasin intracellulaire des nutriments, les plaquettes vitellines. Par conséquent, elles peuvent être cultivées pendant quelques jours dans un milieu défini sans sel supplémentation nutritionnelle ou facteur de croissance du milieu de culture. Nous avons utilisé cette approche pour montrer que les blastomères animaux dorsales ont une capacité autonome pour produire des neurones et des tissus mésodermiques dorsales dues à hérité de la mère ARNm ^{10, 11,} et d'autres ont montré que la spécification du mésoderme de 32 cellules blastomères s'appuie à la fois sur l'information intrinsèque et extrinsèque ¹² . Un avantage de la culture de cellules comme explants, c'est que le milieu peut également être complétée par des facteurs de signalisation définis afin de déterminer quelle cellule-à-cellule voie de communication pourrait influer sur le sort de la cellule explanté ^{12, 13, 14.} En outre, on peut injecter le pr blastomèreIOR de culture avec de l'ARNm de surexprimer un gène, ou par des oligonucléotides anti-sens pour prévenir la traduction des ARNm endogènes. Ceux-ci, gain et perte de fonction des analyses permettent d'identifier les molécules sont nécessaires pour un destin autonome exprimé. Pour analyser le sort de l'explant, l'identification des types cellulaires spécifiques peuvent être effectuées par l'expression des gènes standard (par exemple, l'hybridation in situ, RT-PCR) et des tests immunocytochimiques. Ce protocole fournit un moyen simple, mais puissant, moyen de distinguer entre les mécanismes intrinsèques et extrinsèques qui régissent la façon dont une cellule embryonnaire se développe dans des tissus spécifiques.

Protocole

1. Préparation des instruments, de la Culture et des Médias Plats

1. Aiguisez quatre pinces à l'aide de film abrasif d'alumine. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour contrôler la taille de la pointe. Une paire de pince sert de back-up au cas où un embout est endommagé lors de la procédure. Autoclaver les quatre pinces et conserver dans un contenant stérile.
2. Assurez 500 ml de milieu de culture 0,1 X 1,0 X et (que ce soit Sonneries Marc jour [MMR] ou modification de Barth Saline [MBS]; recettes à ¹⁵⁾ et le filtre à stériliser. Nous utilisons régulièrement MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM de CaCl _2, 1 mM MgSO _4, 5 mM d'HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO _3). Entreposer à 14-18 ° C pendant plusieurs mois.
3. Faire une solution à 2% d'agarose dans un milieu de culture (2 g d'électrophorèse d'agarose de qualité dans 100 ml de milieu de culture 1X dans une bouteille en verre bouchon à vis). Autoclaver à dissoudre l'agarose. Cela peut être conservé à 4 ° C pendant des mois, et au micro-ondes pour liquéfier la gélose lors de sa prochaine nécessaire.
4. Alors que l'agarose est liquide, verser environ 0,5 ml sur le fond de chaque puits d'une plaque de culture de 24 puits stérile. Cela permettra d'éviter les explants de coller au plastique.
5. Alors que l'agarose est liquide, verser environ 2-3 ml sur le fond de deux à trois boîtes de Pétri de 60 mm, et agiter doucement pour s'assurer que le fond est couvert. Ils serviront de plats de dissection et l'empêche d'agarose embryons de coller à la fois les membranes en matière plastique sont retirés.
6. Lorsque la gélose a refroidi et durci, la flamme de la pointe d'une pipette 6 "Pasteur jusqu'à ce qu'il fonde en boule, et légèrement toucher à la surface de la gélose dans chaque puits de la plaque de culture. Cela va créer une dépression peu profonde dans laquelle l'explant sera placé.
7. Remplir chaque puits de la plaque de culture avec 1X milieu de culture stérile.
8. Lorsque la gélose a refroidi et durci, remplissez le plat dissection avec un milieu de culture diluée (0,1 X 0,1 X MMR ou MBS) pour faciliter la séparation de blastomères.

2. Sélection des embryons

1. Obtenir des œufs fécondés et enlever le manteau de gelée selon les protocoles standard de ^15. Les transférer à 0.5X milieu de culture dans une boîte de Petri de 100 mm.
2. Lorsque les embryons atteignent le stade 2-cellules, trier ceux dans lesquels le sillon premier clivage divise la zone légèrement pigmenté dans l'hémisphère animal (figure 1) dans un plat à part. Ce seront les bailleurs de fonds pour les explants. Gardez le reste des 2-cellules d'embryons dans un plat séparé à côté des embryons donateurs tout au long de la procédure pour servir de témoins frères et sœurs de mettre en scène les explants.

3. Préparation des explants

1. Placez embryons 5-10 dans un plat de dissection, mais ne fonctionne que sur un seul embryon à la fois.
2. Positionner le premier embryon de sorte que la membrane vitelline transparent on peut le voir, il est séparé par un espace libre (espace périvitellin) au-dessus de la surface du pôle animal de l'embryon. En utilisant une force aiguiséps dans la main sous-dominante (la main gauche si on est droitier), saisissez la membrane vitelline au-dessus de l'espace périvitellin. En utilisant une pince aiguisée dans l'autre main, saisir la membrane proche de la première pointe pince et tirez doucement dans des directions opposées à peler la membrane de suite. Faire la saisie initiale à une distance à partir de la cellule qui doit être découpé, de sorte que la cellule cible n'est pas endommagé lors du retrait de la membrane. On peut dire que la membrane a été supprimé parce que l'embryon va aplatir.
3. Saisir une cellule voisine avec la pince à la main et sous-dominante d'utiliser cette cellule comme une "poignée" si la cellule doit être découpé n'est pas directement touchée. Avec la pince dans l'autre main, tirez doucement sur les cellules restantes voisins loin du blastomère désiré. Si les cellules médianes, qui partagent le même sort, sont ciblés, ils peuvent être enlevés ensemble comme une paire. Enfin, disséquer l'écart de la «poignée» de cellules.
4. Décrochez le blastomère (ou une paire blastomère), avec une solution stérile, Pipette Pasteur en verre, en évitant les bulles d'air et d'aspiration excessive. La pipette peut être polie au feu pour éliminer les bords coupants qui pourraient endommager la cellule, mais nous ne sommes pas systématiquement faire. Placer la pointe de la pipette Pasteur sous la surface du milieu de culture dans un puits de la boîte de culture d'explant, et doucement expulser le blastomère. Il doit glisser dans la dépression peu profonde par gravité. Le blastomère même de plus d'un embryon peuvent être combinés en un seul explant.
5. Répétez cette procédure avec les embryons restants dans le plat de dissection, un par un. Après environ 10 embryons, le plat de dissection sera rempli de débris cellulaires. Lorsque cela se produit, changez pour un plat de dissection douce.
6. Après toutes les dissections sont faites, vérifiez si les explants sont dans les dépressions peu profondes. Sinon, ils peuvent être doucement poussée dans la dépression avec une boucle de cheveux qui a été stérilisé dans de l'éthanol 70% et séché à l'air.
7. Environ une heure après la dissection dernière, enlever les débris surrounding les explants guéris avec une solution stérile, une pipette Pasteur en verre.
8. Culture de la plaque d'explants à 14-20 ° C à côté de la boîte de Pétri contenant de la fratrie, embryons témoins. Embryons frères et sœurs indiquera le stade de développement des explants blastomères.

4. Les explants de récolte pour l'analyse

1. Récolter les explants lorsque les frères et sœurs atteindre le stade de développement souhaité. Ces explants survivent très bien, même si certaines des cellules se désintégrer. Par conséquent, s'il ya une masse nuageuse dans le puits de culture, l'explorer avec une boucle de cheveux ou une pince pour déterminer si un explant de santé est enterré à l'intérieur.
2. Procurez-vous des explants dans un petit volume de solution de culture avec une pipette Pasteur en verre, et doucement les expulser dans un tampon de lyse approprié fixateur ou pour le dosage à effectuer.

Résultats

La capacité de ce test pour évaluer précisément le potentiel de développement de la cellule repose sur la dissection sur le blastomère correcte basée sur le sort des cartes ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Par conséquent, il est essentiel de choisir des embryons avec le motif de la pigmentation correcte au stade 2-cellules, comme illustré à la figure 1, qui par la suite se conformer aux habitudes régulières de clivage, comme l'illustre la figure 2. Si l'on observe les embryons triés qu'ils ...

Discussion

Les étapes les plus importantes pour la culture réussie des blastomères individuels sont les suivants: 1) identifier correctement le blastomère d'intérêts; 2) le maintien d'un stérile, culture saine; 3) les cellules de dissection à la partie appropriée du cycle cellulaire, et 4) l'élaboration du manuel nécessaire dextérité pour éviter des dommages lors de la dissection et de transférer à la culture bien.

Pour manipuler blastomères spécifiques, il est essentiel d'être capable ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Alumine film abrasif	Thomas Scientific	# 6775E-38	Cours (12 um), pour des réparations majeures des extrémités de la pince
Alumine film abrasif	Thomas Scientific	# 6775E-46	Moyen (3 um), pour bien aiguiser des extrémités de la pince
Alumine film abrasif	Thomas Scientific	# 6775E-54	Fine (0,3 um), pour le polissage des extrémités de la pince
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie N ° 5	Outils Fine Science	# 11252-30	Celles-ci ont les pointes fines qui n'ont pas besoin d'affûtage lors de la première acquisition. Résistant à la corrosion afin qu'ils puissentêtre autoclavés.
Solution de gentamicine	Sigma	G1397	Ajouter à moyenne le même jour que l'utilisation