Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Résumé

L'expression ectopique est une technique permettant d'éclaircir le rôle des microARN dans le développement du cerveau. Cependant, le ciblage des zones spécifiques à l'aide de l'électroporation in ovo est un défi. Ici, nous montrons de manière efficace à des régions du mésencéphale ventral et dorsal sélectivement l'électroporation.

Résumé

Les ARN non codantes sont des acteurs supplémentaires dans la régulation de l'expression génique. Ciblée dans électroporation in ovo de domaines spécifiques fournit un outil unique pour le contrôle spatial et temporel de l'expression de microARN extra-utérine. Cependant, les structures du cerveau comme le mésencéphale ventral ventrales sont plutôt difficiles à atteindre pour tous les manipulations. Ici, nous démontrons un moyen efficace pour l'électroporation des miARN dans le mésencéphale ventral en utilisant des électrodes de platine minces. Cette méthode offre un moyen fiable pour transfecter des zones spécifiques du cerveau moyen et un outil utile pour les études in vivo.

Introduction

La reconnaissance de petits ARN non-codants que les joueurs supplémentaires pour l'expression du gène a lancé une nouvelle complexité à la réglementation génomique programmation / de gène. Différentes espèces d'ARN non-codants ont une importance fonctionnelle dans les cellules neuronales, y compris les petits ARN non-codant ^1-4. Les microARN miR (ou miARN) par exemple montrent des profils d'expression distincts et l'évolution dans le cerveau en développement ^5. Ciblée dans électroporation in ovo d'embryons de poulet offre une occasion unique pour le contrôle temporelle et spatiale de l'expression génique et de la répression au cours du développement.

Cette vidéo montre les différentes étapes de réalisation d'expression ectopique de mirs dans des zones spécifiques du cerveau moyen de poussin en utilisant l'électroporation in ovo ^6-10. Pour assurer un effet de longue durée de ces petits ARN non codants dans les cellules, la séquence d'ADN de mirs ont été clones dans des vecteurs de mono-ou bi-cistroniques. Pour en électroporation in ovo, miR contenant vecteur est injecté dans le tube neural par exposition du mésencéphale embryonnaire après avoir effectué une petite fenêtre dans la coquille de l'oeuf. Pour transfecter des zones spécifiques du petit plus mésencéphale (anode) et moins (cathode) électrodes de platine sont placés à des positions spécifiques. Pour la transfection du mésencéphale ventral, l'anode est placée sous le mésencéphale ventral gauche et la cathode au-dessus de la moitié droite du mésencéphale avant l'application d'un courant. L'ouverture dans la coquille d'oeuf est fermé avec la bande et les embryons sont incubés pendant aussi longtemps que nécessaire pour toute l'analyse. Cette méthode a été décrite par Muramatsu et al. ⁶ et amélioré par Momose et al. ⁸ pour la zone transfection spécifique.

Vue d'ensemble schématique.

1. L'embryon dans l'œuf est exposée en coupant une petite fenêtre en ee coquille.
2. Le vecteur (s) en solution est injecté dans le mésencéphale en utilisant un micro-capillaire.
3. Deux électrodes placées parallèlement - ou en dessous et au-dessus de l'embryon, - générer un champ électrique pulsé.
4. Le champ électrique crée temporairement des pores dans la membrane cellulaire, ce qui facilite l'entrée dans la cellule par l'ADN chargé négativement (ou d'ARN) attirés par l'anode ^11,12.

Protocole

Une. Exigences pour les ovo En électroporation

1. Préparation de la construction de vecteur: miR amorces sens et antisens ont été conçus après les instructions de Ambion, recuits et ligaturées dans Apal / digéré par EcoRI U6.1 vecteur pSilencer. Après une transformation réussie des clones résultants a été cultivée et pSilencer plasmide a été isolé par la méthode de la lyse alcaline à l'aide d'un kit de préparation Qiagen midi.
2. Électrodes: Les électrodes peuvent être achetés ou facilement être construits ^13. Nous utilisons des électrodes de self-made de fil de platine (Φ = 0,2, 0,25 ou 0,5 mm de diamètre) ou, dans certains cas, un fil-électrode de tungstène encore plus faible (Φ = 0,1 mm) ⁸ en fonction de la zone que nous voulons pour l'électroporation. Pour éviter de brûler du tissu, nous utilisons en règle générale la plus proche du tissu le plus mince des électrodes. Pour large électroporation de mésencéphale, nous utilisons 0,5 fils de platine mm soudées à un tube laiton / acier inoxydablearbre et fixée à un porte-électrode avec un rayon de 5.3 mm (figure 1). Pour l'électroporation des domaines spécifiques, on utilise 0,25 mm anodes en fil de platine de 0,2 mm et un fil de platine ou de tungstène de 0,1 mm de la cathode à une distance d'environ 1 mm ou moins.
3. Solutions: Demandez les solutions suivantes Prêt:
   1. Assortie de poulet à l'autoclave, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g de KCl, 0,24 g de CaCl2, dissoudre dans 1 L d'eau distillée).
   2. PBS (NaCl 8 g, 0,2 g de KCl, 0,24 g de KH ₂ PO 4, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, dissoudre dans 1 litre _de H ₂ O distillée).
   3. Fast Green: solution mère à 10 mg / ml H ₂ O distillée
   4. Encre de séchage lent (moins de laque et donc moins empoisonnement de l'embryon). Remarque: un filtre dichroïque bleu fixé à une lampe à fibre optique tel que décrit dans Canto-Soler et Adler ¹⁴ améliore le contraste et peut éliminer la nécessité d'injecter de l'encre.

Figure 1. Diagramme schématique des électrodes et du porte-électrode. (A, B, C), le fil de platine est soudé à un côté d'un arbre tubulaire en acier inoxydable. Un trou a été percé dans l'autre extrémité de l'arbre tubulaire ainsi que des fiches à broches peuvent s'adapter po (A) et de fils de couleur rouge bleu ont été connectées aux fiches à broches. À l'autre extrémité du fil a été installé sur les fiches bananes qui travaillent avec les prises électriques de la électroporateur. (A, C) Le fil de platine a été plié en un ange de 90 °. Une couche de vernis à ongles isolé l'arbre au-dessus du coude.

2. Préparatifs directement devant Dans ovo électroporation

1. Préparer le matériel suivant:
   1. Diluer l'encre avec du poulet sonnerie 01:06, ajouter la solution antibiotique-antimycosique (100x de GIBCo) 1:100.
   2. Préparer la solution de vecteur: 1-2 pg / pl par ADN spécifique en H ₂ O complété avec Green rapide (1:20).
   3. Stériliser pinces, ciseaux, aiguilles de tungstène et des électrodes avec 70% d'éthanol.
   4. Tirer micropipettes pour l'injection de l'acide nucléique à partir de capillaires en verre de borosilicate (longueur à diamètre extérieur: 100 mm x 0,9 mm). Nous utilisons simple extracteur PUL-1 (WPI, Berlin) avec les paramètres indiqués dans le tableau 1.
   5. Régler les paramètres de l'électroporateur comme indiqué dans le tableau 2.

Paramètres	Valeurs
Chaleur	350
Tirer	100
Vitesse	50
Retard	200

Tableau 1. Réglages pour PUL-1

Paramètres	Valeurs
Fréquence	50 Hz
Retard	20-50 msec *
Largeur	20 msec
Tension	8-25 V *
Impulsion	3 - 5 fois
* Selon le diamètre de l'électrode et de la distance. S'il vous plaîten tenir compte lors du changement de l'un des paramètres.

Tableau 2. Réglages pour le stimulateur d'impulsions

2. Préparer des embryons de poulet pour l'électroporation:
   1. Incuber des oeufs de poule fécondés, de leur côté plus de 37 ° C avec 65% d'humidité pour 39 h d'acquérir embryons entre Hamburger & Hamilton (HH) met en scène ¹⁵ 9-11. L'embryon s'installe à la partie supérieure de l'œuf, de sorte que vous devrait marquer avec un trait de crayon.
   2. Désinfecter les œufs avec 70% d'éthanol.
   3. Percer l'œuf à son côté plus large, où la cavité d'air devrait être.
   4. Retirez 1-2 ml de blanc d'oeuf. Cela détacher l'embryon de la coquille.
   5. Cello-bande la coquille pour éviter les éclats d'obus tombent sur l'embryon. Utilisez une paire de ciseaux pour couper une petite fenêtre dans la coquille autour de la ligne de crayon.
   6. Injecter un peu d'encreen dessous de la zone opaca de visualiser l'embryon.
   7. Faire une coupe dans la membrane vitelline avec une aiguille de tungstène aiguisées pour obtenir une meilleure accessibilité de l'embryon pour l'injection de l'acide nucléique et l'électroporation.

3. Électroporation et incubation

1. Ajouter quelques gouttes de solution de Ringer chaud sur les embryons. Cela permettra de diminuer les embryons, d'éviter toute surchauffe, le collage des électrodes au tissu et à fournir un support pour le courant entre les deux électrodes.
2. Injecter la solution de vecteur dans la lumière du tube neural au niveau du mésencéphale. Si le vecteur d'expression d'ADN ne contient pas de gène rapporteur (par exemple EGFP), ajouter un vecteur de gène rapporteur légèrement inférieure concentré (1 ug / ul miR vecteur exprimant à 0,9 ug / vecteur du gène rapporteur ul) à la solution d'ADN. Cela permettra d'assurer que vous reconnaissez cellules transfectées plus tard ^8. Nous utilisons le vecteur soi-disant pCAX, un cadeau aimable vientm C. Krull ^13.
3. Pour une large transfection du mésencéphale, placer les électrodes gauche et à droite de l'embryon à la hauteur du mésencéphale. La distance entre les électrodes doit être d'environ 3-5 mm. Les autres paramètres sont 15V, 20 impulsions ms et 50 ms de retard pour HH 10. Le changement de position des deux électrodes légèrement le long de la (DV) axe dorso-ventral du mésencéphale assure une plus large transfection de cellules de la transfection de l'axe de DV.
4. Pour la transfection ventrale, ajouter un peu de sonnerie de relever la tête de la membrane du jaune et placer l'anode sous mésencéphale ventral. Si la tête ne dépasse pas pousser l'électrode sous la membrane qui sépare le jaune et l'embryon d'éviter de brûler du tube neural. La cathode doit être placé au-dessus du mésencéphale dorso-latérale opposée à l'anode. Ne touchez pas le tube neural. Nous transfecter la moitié ventrale du mésencéphale gauche pour éviter des difficultés avec le développement du cœur. La distance entre les électrodesest d'environ 1-0,5 mm, le reste des paramètres sont 10V, 20 msec de large et 50 ms de retard.
5. Appliquer une goutte de solution saline sur des embryons pour la refroidir et enlever les bulles d'air.
6. Sceller les oeufs avec la bande et incuber pendant au moins 4 heures, le temps minimum requis pour l'expression de vecteur.

4. Fixation des embryons de poulet

1. Retirez les embryons de leurs œufs.
2. Embryons nettoyer sous un stéréomicroscope et d'évaluer l'ampleur de la transfection avec un microscope stéréo fluorescent.
3. Fixer les embryons pendant la nuit dans 4% PFA à 4 ° C. Procéder à la coupe et / ou coloration (hybridation in situ, immunohistochimie) pour analyser les changements dans le domaine transfectées.

Résultats

L'étendue de la région mésencéphalique transfectée avec miR est visible au travers de l'expression de GFP à partir d'un vecteur rapporteur injectée en même temps que le vecteur exprimant miR (figure 2). En utilisant des électrodes en platine d'un diamètre de 0,5 mm et placée parallèlement à l'axe AP du conduit mésencéphale normalement à la transfection d'une large zone le long de la et DV-AP-axe, dont rhombencéphale, le mésencéphale, et parfois diencéphale (figures 2A et ...

Discussion

Cette vidéo montre une méthode efficace pour transfecter le plasmide dans les cellules neuro-épithéliales des zones spécifiques du cerveau moyen de poussin. Impulsions électriques rectangulaires de basse tension peuvent introduire de l'ADN dans des cellules du tube neural de poussin in ovo ^6,16. Toutefois, la précision de ciblage de l'ADN est souvent entravée par le champ électrique de large, qui s'élève à travers les relativement grandes électrodes (Φ = 0,5 mm). Nous avons essayé de s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Capillaires en verre borosilliqué	Hartenstein		Modèle : 0,9 mm
Extracteur microcapillaire	WPI, Berlin		Modèle : Pul1-E
Électroporateur	Intracel		Modèle : TSSIC
Stéréomicroscope - fluorescence	LEICA		: MZFLIII
Stéréomicroscope	Zeiss		Modèle : Stemi
Caméra et logiciel	Zeiss		: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8

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