Une seule molécule d&#39;imagerie du règlement Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilisation de l&#39;activation par clivage cotraductionnelle (COTRAC)

Résumé

Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC), à l'image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode a été utilisée pour suivre la dynamique d'expression stochastique d'un facteur de transcription, le λ répresseur CI ¹.

Résumé

Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC) à l'image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode permet de compter le nombre de molécules de protéines produites dans une cellule pendant séquentielles, des fenêtres de temps de cinq minutes. Il nécessite un microscope à fluorescence avec la densité de puissance laser d'excitation d'environ 0,5 à 1 kW / cm ^2, ce qui est suffisamment sensible pour détecter des molécules simples protéine fluorescente dans les cellules vivantes. Le rapporteur fluorescent utilisé dans cette méthode se compose de trois parties: une séquence ciblage membranaire, une maturation rapide, protéine fluorescente jaune et une séquence de reconnaissance de protéase. Le rapporteur est fusionnée de manière traductionnelle à l'extrémité N-terminale d'une protéine d'intérêt. Les cellules sont cultivées sur une platine de microscope à température contrôlée. Toutes les cinq minutes, des molécules fluorescentes dans les cellules sont imagés (et plus tard coopérationUnted en analysant les images de fluorescence), puis photobleached de sorte que seules protéines nouvellement traduits sont comptés dans la mesure suivante.

Images de fluorescence résultant de cette méthode peut être analysée par la détection des taches fluorescentes dans chaque image, en les affectant à des cellules individuelles, puis affecter les cellules de lignées cellulaires. Le nombre de protéines produites à l'intérieur d'une fenêtre temporelle dans une cellule donnée est calculé en divisant l'intensité intégrée de taches de fluorescence par l'intensité moyenne des molécules fluorescentes simples. Nous avons utilisé cette méthode pour mesurer les niveaux d'expression de l'ordre de 0-45 molécules simples 5 fenêtres de temps min. Cette méthode nous a permis de mesurer le bruit dans l'expression de l'IC λ répresseur, et a de nombreuses autres applications potentielles en biologie des systèmes.

Protocole

1. Souche Ingénierie flux de travail

1. Insérer séquences codant pour (a) une séquence de localisation membranaire, (b) une protéine de maturation rapide fluorescent et (c) une séquence de reconnaissance de protéase N-terminale à et en phase avec une protéine d'intérêt (par exemple un facteur de transcription). Nous avons utilisé la membrane cible Tsr-Vénus reporter ² et fusionnée à la séquence de reconnaissance de protéase ubiquitine (Ub) pour compter le nombre de bactériophage λ exprimées répresseur CI molécules de protéines. Détails sur la façon dont nous avons construit la protéine de fusion Tsr-Vénus-Ub-CI, en remplaçant le type sauvage CI région codante et en intégrant la construction dans la E. chromosome coli en utilisant λ Rouge recombinaison ^3, sont décrits en détail dans la référence. 1.
2. Vérifiez toutes les modifications par séquençage.
3. Transformer un plasmide codant pour une protéase spécifique de la séquence de reconnaissance utilisé ci-dessus dans une souche exprimant la protéine rapporteur fluorescent et d'intérêten fusion traductionnelle. Nous avons utilisé la protéase Ubp1, qui clive immédiatement après le résidu C-terminal de l'ubiquitine ^4.

2. Les cellules de la Culture et préparer l'échantillon

1. Choisissez un E. coli colonie d'intérêt à partir d'une plaque de gélose fraîchement striée en 1 ml médias M9 minimum ⁵ complété avec des acides aminés et MEM 1X antibiotiques appropriés. Incuber dans un shaker à la température désirée assez long pour atteindre OD _600> 1,0 (densité optique à 600 nm).
2. Diluer la culture dans 1 ml de milieu M9 frais avec des antibiotiques appropriés à _DO600 = 0,02. Incuber dans un shaker à la température appropriée. Densité cellulaire initiale peut être augmentée si nécessaire à la croissance à basse température.
3. Lorsque la DO ₆₀₀ = 0,2 à 0,3 (à 37 ° C avec une culture cellulaire initiale à _DO600 = 0,02, cela prendra 3-4 heures), commencer à préparer le gel d'agarose tampon (étape 3).
4. Les cellules sont prêtes pour l'imagerie lorsque OD _{600 = de 0.3 à 0.4.}
5. Transférer 1 ml de culture incubé dans un tube de 1,5 ml, centrifuger à 10.000 xg pendant 1 min dans une centrifugeuse de paillasse.
6. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu frais M9 et remettre en suspension le culot doucement.
7. Centrifuger à 10000 g pendant 1 min.
8. Répétez l'étape 1,6 et 1,7. Jeter le surnageant.
9. Resuspendre doucement dans 1 ml de milieu M9. Les cellules peuvent être directement utilisés pour l'imagerie microscope ou 10 diluée - à 100 fois pour garantir de faibles densités cellulaires pour l'imagerie timelapse. Notez que de faibles densités cellulaires sont importantes pour l'imagerie timelapse prolongée. La chambre de formation d'image (étape 4) est rendue étanche lors de l'expérience. En raison de la croissance exponentielle des cellules, les concentrations cellulaires initiales élevées peuvent sensiblement épuiser l'oxygène à l'intérieur de la chambre de croissance après prolongée dans le tampon de gel, ce qui réduit la maturation des protéines fluorescentes et affecter la croissance des cellules.

3. Préparer la solution d'agarose

1. Peser 10-20 mgà faible température de fusion d'agarose dans un tube de 1,5 ml.
2. Ajouter le volume de milieu minimal M9 sans antibiotiques pour faire une solution à 3% d'agarose.
3. Chauffer la solution d'agarose pendant 30 min à 70 ° C pour faire fondre, retournant le tube pour que la solution soit complètement fondu et homogène. Le tampon de gel peut être versé à ce moment (étape 4) ou de la température peut être réduite à 50 ° C et maintenu pendant plusieurs heures pour une utilisation ultérieure.

4. Préparer Pad Gel sur la chambre

1. Environ 50 min avant l'imagerie, rincer une diapositive Microaqueduct avec de l'eau.
2. Rincé une nettoyés couvercle en verre (en utilisant une méthode de nettoyage strictes telles que celle décrite dans ⁶⁾ et Microaqueduct diaporama avec de l'eau stérile et sécher par soufflage à l'air comprimé.
3. Placer le joint d'étanchéité en caoutchouc sur la lame Microaqueduct de manière à recouvrir les orifices d'entrée et de sortie sur le côté de la lame de verre Microaqueduct (ceci peut être modifié pour des applications dansles supports qui sont perfusés à travers l'échantillon). Appliquer 50 ul de solution d'agarose (étape 3) au centre de la diapositive Microaqueduct.
4. Haut de la solution d'agarose avec le nettoyage, couvercle en verre sec.
5. Laissez la solution d'agarose reposer à température ambiante pendant 30 min.
6. Pendant ce temps, préparer un échantillon de cellules (étape 2).
7. Soigneusement détacher la vitre de protection de la partie supérieure du tampon de gel. Ajouter 1,0 ul de culture cellulaire lavée vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min pour la culture d'être absorbée par le tampon de gel. Il est important de ne pas attendre aussi longtemps que les overdries coussin de gel, mais suffisamment longue pour que les cellules sont correctement respectées le coussin de gel. Le temps d'attente Idéal varie selon la température et de l'humidité.
8. En attendant, une autre sécher couvercle en verre préalablement nettoyé.
9. Couverture de l'échantillon avec la nouvelle vitre de protection en sorte que le verre de protection et Microaqueduct coulisseau sont bien alignés.
10. Assemblez la chambre de croissance à température contrôlée suivant les instructions du fabricant.Il peut maintenant être utilisé pour l'imagerie de microscope (étape 5).

5. Imagerie et acquisition de films Timelapse

1. Allumez le laser et du microscope en suivant les instructions du fabricant (par exemple, le laser peut être nécessaire de réchauffer pour ~ 0,5 h avant l'expérience).
2. Verrouiller la chambre assemblé à l'insert de phase sur le microscope. Régler la température de la chambre de croissance et le chauffe-objectif à 37 ° C ou autre température de croissance souhaitée.
3. Si l'imagerie dessus de la température ambiante, la mise au point ou coussin de gel est généralement dériver de façon significative pour ~ 15 min après le changement de température initiale. Dans la pratique, utiliser ce temps pour trouver des régions d'intérêt et modifier des scripts d'imagerie que nécessaire pour une expérience.
4. Trouver des cellules sur le microscope et stocker la position de chaque cellule après son centrage à l'intérieur d'une région d'imagerie prédéfinie et alignés. Plus d'une cellule peut être imagé dans chaque fenêtre de temps d'acquisition d'image. Pour plus timelapse imagerie mdes générations, en sorte que les cellules de représentation sont initialement séparés à partir d'autres cellules par au moins quelques centaines de micromètres de telle sorte que les autres colonies n'entrera pas dans la région de formation d'image en cours de croissance.
5. Réglez l'intensité d'excitation laser de sorte que la quasi-totalité des molécules fluorescentes photoblanchiment dans les 6 expositions (figure 5).
6. Utilisation d'un script automatisé d'imagerie / journal, l'acquisition de données timelapse en utilisant l'algorithme décrit dans le flux de travail expérimental sur la figure 3.

Résultats

Des résultats typiques d'une expérience COTRAC le suivi de la production de l'IC λ répresseur sont présentés dans les figures 4 et 5. Dans cette expérience, 12 colonies ont été imagées à intervalles de 5 min. A chaque point dans le temps, la colonie a d'abord été autofocused et centralisé au sein de la zone d'exposition. Ensuite, la position centrée / ciblée a été enregistré et une image de fond clair a été acquise. L'étape est ensuite transporté par ~ 0,5 um long de...

Discussion

La méthode COTRAC peuvent être généralisés à mesurer la production d'autres protéines où N-ou C-terminaux conventionnels fusions de protéines fluorescentes peuvent perturber l'activité des protéines. La stratégie COTRAC a trois avantages uniques par rapport aux méthodes actuelles. Tout d'abord, co-traductionnelle de fusion assure une molécule de rapporteur fluorescent est le produit pour chaque molécule de la protéine d'intérêt, ce qui permet un comptage précis de la production de protéines en temps réel...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Agarose (température de fusion basse)	Lonza	50100
Milli-Q H 2 O
5 × sels M9			Recette suivante décrit en 9
Glucose à 20%
MgSO 4
CaCl 2
50 x solution d'acides aminés MEM	Invitrogen	11130-051
À température contrôlée croissanceChambre Adaptateur étape	Bioptechs	FCS-2
Chauffage objectif	Bioptechs	Modèle dépend de l'objectif de microscope
Microaqueduct Diaporama	Bioptechs	130119-5
Verrres micro	VWR	40CIR-1	Peuvent être difficiles à trouver; également disponible à partir Bioptechs
Couverture en verre / coulissant joint	Bioptechs	FCS2 0,75 mm
Microscope à fluorescence	Divers	Exemple de configuration: Coherent Innova 308C laser argon-ion, Olympus IX-81 microscope, Olympus Planapo 100X NA 1,45 objective, Metamorph logiciel	Doit avoir une excitation laser, automatisé xyz stade, le logiciel d'automatisation capable de l'imagerie scénarisé et autofocus, optique capables de résolvineg protéines fluorescentes simples
EM-CCD de la caméra	Divers	Exemple de configuration: Andor Ixon DU-898	Doit avoir un bruit suffisamment faible pour détecter simples protéines fluorescentes dessus du fond