Le dosage de dommages de l'ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l'essai de comète

Résumé

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.

Résumé

Un certain nombre de médicaments ciblent les voies de réparation de l'ADN et induire des cellules tuer en créant des lésions de l'ADN. Ainsi, des procédés pour mesurer directement lésions de l'ADN ont été largement évalués. Les méthodes traditionnelles sont longs, coûteux, et nécessitent beaucoup de ressources de réplication des cellules. En revanche, le test des comètes, un essai de cellule unique électrophorèse sur gel, est plus rapide, non invasif, peu coûteux, mesure directe et sensible de dommages à l'ADN et la réparation. Toutes les formes de dommages à l'ADN ainsi que réparation de l'ADN peut être visualisé au niveau de la cellule unique à l'aide de cette technique puissante.

Le principe qui sous-tend le test des comètes est que l'ADN intact est très ordonnée alors dommages à l'ADN perturbe cette organisation. Les suintements d'ADN endommagés dans la matrice d'agarose et lorsqu'il est soumis à un champ électrique, l'ADN chargé négativement migre vers la cathode qui est chargée positivement. Les brins d'ADN endommagés grands ne sont pas en mesure de migrer loin du noyau. Dommages à l'ADNcrée des fragments d'ADN plus petits qui voyagent plus loin que l'ADN intact. Comet Assay, un logiciel d'analyse d'images, mesures et compare l'intensité globale fluorescent de l'ADN dans le noyau avec l'ADN qui a migré hors du noyau. Signal fluorescent de l'ADN migré est proportionnelle à endommager l'ADN. ADN queue plus claire signifie lésions de l'ADN accrue. Certains des paramètres qui sont mesurés sont actuellement queue qui est à la fois une mesure de la quantité d'ADN et de la distribution de l'ADN dans la queue de longueur de queue, et le pourcentage d'ADN dans la queue. Ce test permet de mesurer réparation de l'ADN ainsi car la résolution des lésions de l'ADN signifie la réparation a eu lieu. La limite de sensibilité est d'environ 50 cassures par ^1,2 cellule diploïde mammalien. Les cellules traitées avec des agents endommageant l'ADN, tels que l'étoposide, peut être utilisé en tant que contrôle positif. Ainsi, le test des comètes est une procédure rapide et efficace pour mesurer dommages à l'ADN.

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Cellules neuronales Culture et les traitent selon les besoins.
2. Récolte des cellules dans des tubes de 15 ml: médias aspirés, rincer avec du tampon phosphate salin (PBS, de calcium et de magnésium libre), ajouter la trypsine, la collecte en tubes de 15 ml et neutraliser la trypsine avec appropriées milieux contenant du sérum.
3. Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min.
4. Aspirer les médias.
5. Remettre en suspension les cellules dans du PBS.
6. Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min.
7. Aspirer les médias et remettre les cellules en PBS frais.
8. Compter les cellules à l'aide d'un h....

Discussion

Le test des comètes a la capacité unique d'analyse de cellules individuelles. Ceci est avantageux pour l'identification des sous-populations de cellules qui démontrent une réponse différentielle aux agents cytotoxiques. A quelques limitations pratiques doivent être prises en compte. Le nombre de cellules qui peuvent être évalués individuellement peuvent varier selon les individus. La taille de l'échantillon doit être augmenté s'il ya variation des dommages à l'ADN dans une population. Viable suspensi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Tubes de 1,5 ml	Santa Cruz Biotechnology, Inc	Sc-200271
10X TBE (Tris base, l'acide borique, de l'EDTA)	Fisher Scientific	BP13331
Tube de 15 ml	Fisher Scientific	0553851
Agarose	Sigma	A5093
Le papier d'aluminium	Fisher Scientific	01213101
Gobelet	Fisher Scientific	FB102300
Centrifuger	Thermo Scientific	75004261PR
Logiciel Comet Assay	Comet Assay IV Système d'analyse d'images
Cylindre	Fisher Scientific	08555F
EDTA	GIBCO	15575
Chambre d'électrophorèse	Thermo Scientific	09528101
L'éthanol	Fisher Scientific	A407P4
Microscope à fluorescence	Zeiss Axio Vision		Toute microscope à fluorescence avec un filtre vert suffira
Hémacytomètre	Fisher Scientific	0267152
D'agarose à faible point de fusion	Promega	V2111
Micro-onde	Sears
Saline tamponnée au phosphate, calcium libre, magnésium libre	HyClone	SH3025601
Alimentation	BioRad	1645050
Réfrigérateur	Sears
Règle	Staples
Glissement	Fisher Scientific	12550143
De chlorure de sodium	Sigma	S7653
L'hydroxyde de sodium	Sigma	S5881
Sodium lauryl sarcosinate	Fisher Scientific	S529
SYBR Green	Invitrogen	S7585
Plateau	Fissa science	15242B
Base de tris	Sigma	T6066
Triton-X 100	Sigma	T8787
Trypsine	HyClone	SH3023601
Vortex	Fisher Scientific	02216108
Bain d'eau	Fisher Scientific	154622Q