Article de méthode

Diluée-skull Technique fenêtre corticale pour

DOI :

10.3791/50053

⸱

19 novembre 2012

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1Division of Biomedical Sciences, University of California, Riverside , 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons une méthode de création d'une fenêtre corticale amincie crâne (TSCW) dans un modèle de souris pour In vivo Imagerie OCT du cortex cérébral.

Résumé

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Tomographie par cohérence optique (OCT) est une technique d'imagerie biomédicale de haute résolution spatio-temporelle. Grâce à son approche minimalement invasive OCT a été largement utilisé en ophtalmologie, dermatologie, gastro-entérologie et 1-3. En utilisant une fenêtre corticale amincie crâne (TSCW), nous employons domaine spectral OCT (SD-OCT) modalité comme un outil pour l'image du cortex in vivo. Communément, un crâne ouvert, a été utilisé pour la neuro-imagerie car il offre une plus grande polyvalence, cependant, une approche TSCW est moins invasive et est un moyen efficace pour l'imagerie à long terme dans les études de neuropathologie. Ici, nous présentons une méthode de création d'un TSCW dans un modèle de souris in vivo pour imagerie OCT du cortex cérébral.

Introduction

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Depuis son introduction dans le début des années 1990, l'OCT a été largement utilisé pour l'imagerie biologique de la structure des tissus et la fonction 2. Octobre génère des images en coupe en mesurant le temps de retard d'écho de 4 lumière rétrodiffusée par la mise en oeuvre à faible cohérence source de lumière avec un interféromètre de Michelson à fibres optiques 2,4. SD-OCT, également connu sous le nom de domaine de Fourier PTOM (FD-OCT), a été introduit en 1995 5 et offre une modalité d'imagerie de qualité supérieure par rapport aux traditionnels dans le domaine temporel OCT (TD-OCT). Dans l'affaire SD-OCT, le bras de référence est maintenue stationnaire résultant en une vitesse élevée et ultra acquisition d'image à haute résolution 6-9.

À l'heure actuelle, les modèles TSCW ont été largement utilisés pour des applications in vivo d'imagerie cérébrale de microscopie à deux photons au lieu d'une craniotomie traditionnelle. Ces TSCW ont été utilisés simultanément avec une plaque de crâne personnalisée ou une lamelle de verre 10-13 à fournir d'autres imaGing stabilité. Dans nos études, nous avons constaté que des accessoires tels que ceux-ci ne sont pas nécessaires pour imagerie OCT quand un TSCW est utilisé. Par conséquent, l'absence d'une plaque de crâne ou des lamelles de verre permet une plus large gamme de taille de la fenêtre d'imagerie, car ils peuvent interférer avec le faisceau optique et modifier des images octobre

Une préparation amincie crâne s'est avérée avantageuse dans les études d'imagerie du cerveau en utilisant la microscopie à deux photons 10-13. Dans nos expériences, nous utilisons un système SD-OCT à l'image du cortex in vivo par un TSCW. La coutume SD-OCT installation d'imagerie contient une large bande, la source de lumière à faible cohérence constitué par deux diodes superluminescentes (SLD) centrés à 1295 nm avec une largeur de bande de 97 nm résultant en une résolution axiale et latérale de 8 um et 20 um, respectivement 14 . Avec notre appareil d'imagerie optique, nous prévoyons que l'imagerie à travers un TSCW a un grand potentiel dans l'identification et la visualisation des structures et des fonctions dans l'otissu cérébral ptically dense.

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Protocole

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1. Préparation chirurgicale

  1. CD 1 souris femelles âgées de 6-8 semaines ont été utilisés dans nos expériences.
  2. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale d'une combinaison de kétamine et de xylazine (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg de xylazine). Placez la souris sur un tapis homéothermes afin d'assurer une température corporelle optimale à ~ 37 ° C Surveiller en permanence le niveau de l'anesthésie en testant les réflexes animal (par exemple, pincer pied avec le forceps émoussé) et injecter plus de l'anesthésie si nécessaire.
  3. Lubrifiez les deux yeux avec une pommade larmes artificielles. Enlever les poils sur le cuir chevelu à l'aide d'un rasoir et enlever les poils résiduel en utilisant 70% de tampons imbibés d'alcool. Appliquer une fine couche de crème Nair épilation sur le cuir chevelu et attendre 2 minutes pour qu'elle prenne effet. Essuyer doucement les cheveux Nair et restant en utilisant une solution saline imbibé des cotons-tiges et tampons de préparation d'alcool. Scalp devrait maintenant être complètement chauve.
  4. Désinfecter le cuir chevelu à l'aide d'un bâton bétadine tige et nettoyer avec 70% tampons imbibés d'éthanol.
  5. Soigneusement envelopper l'animal dans les draps chirurgicaux pour assurer la température du corps optimale de ~ 37 ° C et monter l'animal sur un cadre stéréotaxique pour immobiliser le crâne. Appuyez légèrement sur le crâne pour assurer sa stabilité. Une liste des matériaux utilisés est fournie dans le tableau 1.

2. Diluée-crâne Préparation fenêtre corticale

  1. Démarrez l'incision au point médian entre les deux yeux. Continuer caudalement au point médian entre les oreilles. Partie de la peau avec une pince.
  2. Localisez la zone à éclaircir sous un microscope à dissection et retirez délicatement la façade à l'aide de pinces. Sécher le crâne avec des cotons-tiges stériles avant de créer la fenêtre amincie corticale. Dans nos expériences, nous avons créé un 4 × 4 mm aminci fenêtre crânienne ~ 1 mm postérieure et latérale au bregma.
  3. Commencez amincissement du crâne à l'aide d'une fraise en carbure de tour de taille foret de 0,75 mm dans une perceuse à main chirurgicale en utilisant la lumière ONL mouvement de balayagey. Ne pas appliquer une pression directe sur le crâne. Arrêtez le forage toutes les 20-30 secondes pour enlever la poussière d'os en utilisant une solution saline stérile et tampons de coton et d'éviter la surchauffe du crâne. La solution saline peut aussi aider à dissiper la chaleur à travers le crâne.
  4. Une fois que la couche externe de l'os compact est complètement enlevé la couche d'os spongieux milieu devrait maintenant être visible. Il peut y avoir un léger saignement que les vaisseaux sanguins sont plus apparents dans la couche d'os spongieux. Passez à une fraise pierre verte et continuer le forage en utilisant des précautions supplémentaires que la couche spongieuse est plus délicate. La fraise pierre verte sera enlever de la matière osseuse moindre tout en créant régularité tout au long de la fenêtre crânienne. Arrêtez le forage de temps en temps pour enlever la poussière d'os et de refroidir le crâne.
  5. Enfin, lorsque le crâne est devenu plus transparent et le système vasculaire dans le cerveau est maintenant visible, commencez à polir le crâne à l'aide d'une fraise de polissage. Cela permettra une évaluation plus précise amincissement tout en lissant le crâne. Vérifiez la minceur de l'skull en tapotant doucement sur elle avec une pince. Arrêtez polissage lorsque le crâne est légèrement flexible.
  6. La fenêtre amincie crânienne devrait maintenant être parfaitement lisse et réfléchissante et prêt pour l'imagerie (figure 1). En raison de la nature des tissus fortement diffusantes du cerveau, du crâne doit être dilué à au moins 55 um pour la profondeur de pénétration optimale. Une liste des matériaux utilisés est fournie dans le tableau 1.

3. Tomographie par cohérence optique d'imagerie

  1. Après la chirurgie est terminée, vérifier le taux de respiration des animaux et les réflexes pour assurer un niveau adéquat d'anesthésie et d'administrer une anesthésie supplémentaire si nécessaire. Supprimer animal du cadre stéréotaxique, garder des animaux enveloppé dans les draps chirurgicaux, et le transport des animaux à la station d'imagerie.
  2. Avant d'imagerie vérifier les signes de réflexes et d'appliquer des larmes artificielles supplémentaires si nécessaire. Monter sur des animaux pour la cadre stéréotaxique pour fixer le crâne.
  3. Placer sous animauxOctobre caméra et la position de l'TSCW sous le faisceau optique (figure 2). Une vue en coupe transversale du crâne et le cerveau peuvent maintenant être visualisées (figure 3).
  4. L'acquisition des données peut commencer une fois domaine d'intérêt est située. À des fins d'imagerie, on utilise des miroirs galvanométrique pour réaliser une fenêtre de formation d'image avec une largeur de 4,0 mm. Une profondeur d'imagerie de 2 mm a été obtenue avec 6 mW de puissance incidente et un point focal 1 mm au-dessous du crâne amincie. Chaque surface de section transversale se composait de 2.048 balayages axiaux avec un taux d'acquisition de 0,14 secondes par image.
  5. Balayages volumétriques du cerveau peut également être obtenue en recueillant une série de 2D des images en coupe à l'aide de deux jeux de miroirs de balayage galvanométrique pour xy par le miroir galvanométrique premier balayage du faisceau dans la direction sagittale et le deuxième miroir de galvanomètre de balayage dans la coronaire direction.

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Résultats

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Après avoir créé une fenêtre amincie sur le cortex cérébral du système vasculaire devrait maintenant être visuellement plus importante (Figure 1) et permettra une profondeur plus grande image (jusqu'à 1 mm). Le cortex droit est amincie à environ 55 um par rapport à un crâne normal mesuré à 140 um (figure 1) et fournit une plus grande clarté optique. Dilution supplémentaire à 10-15 um est possible 11 cependant pas nécessaire que l'utilisation de lamelles de verre et de...

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Discussion

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Imagerie par OCT et amincie crâne est un roman de neuro-imagerie technique qui n'a été que récemment enquêté sur 15, 16. Dans nos expériences, nous avons démontré la faisabilité de SD-OCT par un TSCW dans un modèle de souris in vivo. À partir de ces résultats, le crâne est amincie à environ 55 um et la profondeur de pénétration est obtenue à environ 1 mm avec une résolution d'image de 8 um et 20 um dans la direction axiale et latérale, respectivement. Dans le profil d'intensité de signal,...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la preuve UC Découverte de la subvention Concept et par le NIH (R00 EB007241). Les auteurs tiennent également à remercier Jacqueline Hubbard pour son aide dans cette expérience.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériels Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
La kétamine Phoenix Pharma 57319-542-02
Xylazine Akorn, Inc 139-236
Pommade larmes artificielles Rugby 0536-6550-91
Nair Church & Dwight Co., Inc 4010130
Stérile alcool Prep Pad Kendall Healthcare 6818
Cotton Tipped Applicators Fisherbrand 23-400-115
Tige montée Solution de Bétadine Produits Purdue 67618-153-01
Solution Saline, .9% Phoenix Pharma 57319-555-08
Cadre stéréotaxique Stoelting
Haute Vitesse Perceuse à main chirurgicale Foredom 38000 rpm
Carbide Bur ronde Stoelting 0,75 mm
Dura-Green Pierres Shofu Shank: HP
Forme: BA1
CompoMaster grossier et CompoMaster Polisher Shofu Forme: Mini-Pt.
SpaceDrapes Braintree Scientific, Inc

Références

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