Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Résumé

Nous décrivons ici un ensemble de montage fluorescent In situ Hybridation (FISH) pour la détermination des propriétés d'expression et la localisation des ARN exprimés au cours de l'embryogenèse chez la drosophile, Drosophila melanogaster.

Résumé

Évaluer le profil d'expression d'un gène, ainsi que les propriétés de localisation subcellulaire de ses ARN transcrit, sont des éléments clés pour la compréhension de sa fonction biologique au cours du développement. ARN hybridation in situ (ISH-ARN) est une méthode puissante utilisée pour visualiser les propriétés de distribution d'ARN, que ce soit au niveau de tous les organismes, cellulaires ou subcellulaires ^1. ARN-ISH est basée sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique marquée (par exemple un ARN antisens, oligonucléotides) complémentaire de la séquence d'un ARNm ou d'une cible non-codante d'ARN d'intérêt ^2. Comme la procédure exige des renseignements séquence primaire seul à générer une séquence des sondes spécifiques, il peut être universellement appliquée à un large éventail d'organismes et les échantillons de tissus ^3. En effet, un certain nombre d'études à grande échelle ISH ont été prises pour documenter l'expression des gènes et de l'ARN dynamique de localisation dans divers organismes modèles, ce qui a conduit à lamise en place de ressources communautaires importantes ^4-11. Bien qu'une variété de marquage des sondes et des stratégies de détection ont été développées au fil des ans, l'utilisation combinée des réactifs de détection à marquage fluorescent et enzymatiques étapes d'amplification du signal offrent des améliorations significatives dans la sensibilité et la résolution de la procédure ^12. Ici, nous décrivons une fluorescence optimisé méthode d'hybridation in situ (FISH) utilisant l'amplification du signal tyramide (TSA) pour visualiser l'expression de l'ARN et la dynamique de localisation des embryons de drosophile mis en scène. La procédure est réalisée en format 96 puits Plaque PCR, ce qui facilite grandement le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons.

Protocole

1. Préparation de la sonde d'ARN

Vue d'ensemble: La section suivante décrit les étapes nécessaires pour faire digoxigénine (DIG)-sondes marquées ARN Convient pour les poissons. La première étape consiste à cloner ou PCR amplification d'une séquence correspondant à la région transcrite d'un gène d'intérêt qui sera utilisé pour générer une sonde spécifique de la séquence. Ceci peut être obtenu par clonage premier segment de gène dans un plasmide dans lequel le site de clonage multiple est flanqué par des éléments promoteurs de bactériophage (T7, T3 ou SP6), qui peut alors servir de matrice pour la PCR en u....

Résultats

Quand elle est réalisée avec succès, cette procédure offre un niveau remarquablement améliorée de détail dans l'analyse spatio-temporelle de l'expression génique et la dynamique de localisation d'ARNm au cours de l'embryogenèse précoce chez la drosophile. En effet, comme illustré sur la figure 3A pour l'avorton gène pair-rule classique (piste), on peut utiliser ce protocole pour observer des événements expression des gènes via la détection de foyers transcr.......

Discussion

Pour les étapes de synthèse de la sonde, nous générons habituellement en run-off des sondes d'ARN antisens par transcription in vitro à partir des ADNc pleine longueur drosophile amplifiés à partir des plasmides présents dans la collection de Drosophila Gene (DGC), une ressource en détail à l'adresse suivante: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html ^14,15. Cette approche a été largement utilisé.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
T7, T3 ou SP6 ARN polymérase	Fermentas Life Sciences	EP0101, EP0111, EP0131	Les kits contiennent un tampon de réaction.
DIG RNA Labeling Mix	Roche Applied Science	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
L'acétate de sodium 3M
Froide éthanol à 100%.
Froide éthanol à 70%.
Solution de Javel diluée à 1:1 avec de l'eau.
Heptane
Méthanol
protéinase K	Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada	Catalog No. P2308
Solution de formaldéhyde à 40%, fraîchement préparé
Solution PBS-Tween (PBT)		1xPBS, 0,1% de Tween-20
Solution de glycine		2 mg / ml de glycine en PBT
HRP-conjugué anticorps monoclonal anti-DIG	Jackson Laboratories Inc ImmunoResearch	200-032 - 156	(1/400 de dilution de 1 mg / ml de solution mère dans PBTB
Conjugué à HRP moutons monoclonal anti-DIG	Roche Applied Science, Laval, QC	1 207 733	1/500 de dilution de la solution mère dans PBTB
Biotine-conjugué anticorps monoclonal de souris anti-DIG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA	200-062-156	(1/400 de dilution de 1 mg / ml de solution mère dans PBTB
Streptavidine-HRP	Molecular Probes, Eugene OR, USA	S991	(1/100 de dilution d'un 1 ug / ml de bouillon