Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Résumé

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Résumé

L'immunothérapie du cancer permet d'exploiter la spécificité de la réponse immunitaire à cibler et à éliminer les tumeurs. Thérapie cellulaire adoptive (ACT) basé sur le transfert adoptif de lymphocytes T génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur d'antigène chimérique (CAR) a montré très prometteur dans les essais cliniques ^1-4. Il ya plusieurs avantages à utiliser CAR ⁺ lymphocytes T pour le traitement de cancers, y compris la capacité de cibler des antigènes du CMH non réglementées et pour fonctionnaliser les lymphocytes T pour la survie optimale, tête chercheuse et de la persistance dans l'hôte, et enfin à induire l'apoptose de CAR ⁺ Les cellules T dans le cas de ⁵ toxicité hôte.

La délimitation des fonctions optimales de CAR ⁺ lymphocytes T associés à un bénéfice clinique est essentielle pour concevoir la prochaine génération des essais cliniques. Les progrès récents de l'imagerie des animaux vivants comme la microscopie multiphotonique ont révolutionné l'étude de la fonction des cellules immunitaires in vivo ^6,7. Bien que ces études ont fait progresser notre compréhension des fonctions des cellules T in vivo, des cellules T ACT basée sur des essais cliniques nécessite la nécessité de relier les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des cellules T préparations pré-infusion avec une efficacité clinique après la perfusion, en utilisant en tests in vitro des cellules T surveillance des fonctions telles que, la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines. Standard de cytométrie en flux ont été basés sur des tests élaborés pour déterminer le fonctionnement global des populations de cellules T au niveau d'une seule cellule, mais celles-ci ne sont pas appropriés pour le suivi et la formation de conjugués vie ou la capacité de la cellule même de tuer plusieurs cibles ^8.

Microfabriqués tableaux conçus dans des polymères biocompatibles tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) constituent une méthode particulièrement attrayante pour limiter l'espace effecteurs et des cibles dans de petits volumes ^9. En combinaison avec la microscopie à fluorescence automatisé time-lapse, quoiqueusands d'effecteur-cible interactions peuvent être surveillés simultanément par des puits individuels d'imagerie d'un tableau nanowell. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour la surveillance cytotoxicité à médiation cellulaire T-au niveau d'une seule cellule qui peut être largement appliquée à l'étude de la fonctionnalité des lymphocytes T cytolytiques.

Protocole

1. Préparation des réactifs

1. Préparer un milieu RPMI-PLGH en mélangeant 500 ml du milieu RPMI-1640 et 5 ml de pénicilline-streptomycine, L-glutamine, l'HEPES et de la solution.
2. Préparer R10 solution en mélangeant RPMI-PLGH avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). La FBS est inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min avant l'addition.
3. Préchauffer à 37 ° C 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, et 15 de la R10 dans des tubes coniques stériles.
4. Fabrication des tableaux de nanowells dans PDMS: Le maître de silicium est fabriqué en utilisant la photolithographie essentiellement comme décrit précédemment ^10. Bien mé....

Résultats

Un exemple de l'application de l'analyse à haut débit cytolytique est démontré dans la figure 2. En bref, étiqueté CD19 spécifique CAR ⁺ cellules T ont été co-incubées avec des cellules de souris marqués cibles EL4 dans les puits individuels d'un tableau nanowell (articles 1-5). Une image initiale a été enregistré sur le microscope fluorescent automatisé pour identifier l'occupation (effecteurs et / ou cibles) de chaque nanowell unique sur le réseau (section 6). Traitement de .......

Discussion

Nous avons décrit le protocole pour un haut débit seule cellule d'essai cytolytique activé via la co-incubation des effecteurs et des cibles dans les tableaux de nanowells (figure 1). En plus de débit d'un avantage majeur de cette technique est la possibilité de surveiller effecteur cytotoxicité à médiation contre des cellules cibles désirées sans avoir besoin de l'ingénierie cellulaire cible qui à son tour permet l'utilisation de autologues ou appariés / primaire cellules tumorales que .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI-1640 w / o L-glutamine	Cellgro	15 à 040 CV-
Pénicilline-streptomycine	Cellgro	30-002-CI	10.000 UI de pénicilline 10000 ug / ml de streptomycine
L-glutamine	Cellgro	25 à 005-CI	Solution 200 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Sérum fœtal bovin (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot testé
Cellule Tracker tache rouge	Invitrogen	C34552	50 ug
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
Acide nucléique SYTOX tache verte	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexine V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 pi
PBS Dulbecco	Cellgro	21-031 CV-	500 ml
Agar Noble	DIFCO	2M220	100 g
Bleu trypan	Sigma Aldrich	T8154	0,4% de liquide, on filtre stérile
Hémocytomètre	Hausser Scientifics	1492	Ligne claire
4-plaque à puits	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic nettoyeur à plasma
Observer.Z1	ZEISS		Microscope à fluorescence (fonctionne avec les trois parties ci-dessous)
Lambda 10-3	Instrument Sutter		Contrôleur de filtre
Lambda DG-4	Instrument Sutter		Ultra-High-Speed ​​longueur d'onde de commutation
Hamamatsu EM-CCD de la caméra	Hamamatsu	C9100-13	Microscope caméra CCD
15 ml tube conique	BD Falcon	352097
50 ml tube conique	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Europe BV	Biostation IM
Boîte de culture à fond de verre	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm boîte de Petri de 10 mm micropuits