Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

Nathaniel T. Remlinger; Peter D. Wearden; Thomas W. Gilbert

doi:10.3791/50059

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Article de méthode

Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

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DOI :

10.3791/50059

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6 décembre 2012

Nathaniel T. Remlinger¹^,² , Peter D. Wearden¹^,³ , Thomas W. Gilbert¹^,²^,³^,⁴

¹McGowan Institute for Regenerative Medicine, ²Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, ³Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, ⁴Department of Surgery, University of Pittsburgh

Dans cet article

Résumé

Une méthode pour rapidement et complètement éliminer les composants cellulaires à partir d'un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde est décrite. Cette méthode permet d'obtenir un site spécifique de la matrice extracellulaire cardiaque échafaudage qui a le potentiel pour être utilisé dans de multiples applications cliniques.

Résumé

Perfusion basée sur décellularisation organe entier a récemment suscité un intérêt dans le domaine du génie tissulaire comme un moyen de créer des sites spécifiques échafaudages de la matrice extracellulaire, bien que largement en préservant l'architecture d'origine de l'échafaud. À ce jour, cette approche a été utilisée dans une variété de systèmes d'organes, y compris le cœur, les poumons, le foie et ^1-5. Décellularisation méthodes précédentes pour tissus sans un réseau facilement accessible vasculaire ont invoqué l'exposition prolongée des tissus à des solutions de détergents, acides ou les traitements enzymatiques comme un moyen d'éliminer les composants cellulaires et nucléaires de l'environnement extracellulaire ^6-8. Cependant, l'efficacité de ces méthodes charnière sur la capacité des solutions à imprégner le tissu par diffusion. En revanche, la perfusion des organes à travers le système vasculaire naturel pour effet de réduire la distance de diffusion et de transport facilité de decellularizatides agents dans le tissu et les composants cellulaires sur le tissu. Nous décrivons ici une méthode pour bien decellularize un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde coronaire. Le protocole donné entièrement décellularisé cardiaque matrice extracellulaire (ECM-c) d'échafaudage avec la structure tridimensionnelle du coeur intact. Notre procédé utilisé une série d'enzymes, les détergents, les acides et les produits de rinçage couplé avec hypertoniques et hypotoniques pour aider à la lyse et l'élimination des cellules. Le protocole utilisé une solution de Trypsine pour détacher les cellules de la matrice, suivie par des solutions de Triton X-100 désoxycholate de sodium et d'aider à l'élimination de la matière cellulaire. Le protocole décrit utilise également des vitesses de perfusion de plus de 2 L / min pour des périodes de temps prolongées. La vitesse d'écoulement élevée, associée à des changements souhaités solution transport d'agents dans le tissu sans contamination des débris cellulaires et assurer un rinçage efficace du tissu. La méthode décrite enlevé toutes les matières nucléaires de native porcine tissu cardiaque, la création d'un site spécifique cardiaque ECM échafaudage qui peut être utilisé pour une variété d'applications.

Protocole

1. Préparation des tissus et Experiment Setup

Organe porcin récolte immédiatement après l'euthanasie d'une installation abattoir ou de la recherche et de rincer l'excès de sang. Coupez le cœur de l'excès de graisse et de tissus, en gardant les oreillettes et l'aorte intacte. Coupez le gras de séparer l'artère pulmonaire à l'aorte. S'il ya des coupures dans le tissu, jeter de façon appropriée.
Enveloppez chaque coeur individuellement dans du papier congélateur et stocker tous les tissus dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins 24 h à garantir une congélation complète.
Lorsque vous êtes prêt à l'emploi (généralement moins de 3 mois), le dégel un cœur intact de porc congelé dans de l'eau de type 1 nuit immergé dans un bêcher de 4 L à 4 ° C.
Après le cœur est complètement dégelé, caresser le cœur sec, peser le cœur, et noter le poids. Le cœur d'un cochon poids de marché devrait peser environ 375-450 g.
Connectez taille 18 tube Masterflex à l'¼ "fin d'un réducteur de fer barbelé. Insérez le réducteur de fer barbelé ettube intérieur de l'aorte. Placer les pinces de serrage 2 ou attaches sécurisées autour de l'aorte, juste en dessous du tronc brachio-céphalique. Le réducteur et la tubulure doit rester au-dessus de la valve aortique, de sorte que les artères coronaires peut être perfusé (figure 1).
Utilisez une seringue de 30 ou 60 ml pour remplir le tube avec de l'eau de type I. Insérer le tube dans la cartouche d'une pompe à galet Masterflex en son milieu approximatif. Plonger l'extrémité d'entrée du tube dans le fond d'un bêcher rempli 4 L à 2,5 L d'eau et fixer le tube.
Placez le cœur dans le bécher rempli d'eau, et amorcer la pompe pour éliminer les bulles d'air. Si des bulles sont observées en provenance de l'aorte où le tube est inséré, l'aorte peut être nécessaire de repositionner ou fixé avec des liens supplémentaires. Un joint étanche est important de maintenir une pression adéquate pendant le processus de décellularisation (Figure 2).
Placer le bécher contenant 4 L 3 L de 0,2% NaN% Trypsin/0.05 EDTA/0.05%3 solution sur plaque d'agitation et le réchauffer à 37 ° C dans la préparation du processus décellularisation.

2. Se rince le tissu

Régler la pompe à un débit de 400 ml / min, en veillant à ce que le diamètre de la conduite correcte est sélectionnée. Rincer le cœur avec Eau de type I pour 15-25 min. Comme la pompe est démarrée, le cœur doit gonfler et écouler le sang des ventricules. Une solution fraîche doit être remplacé tous les 5-10 minutes, ou selon les besoins en fonction de la quantité de sang prélevée à partir du cœur. Si le sang n'est pas épanché du cœur, ajustez le tuyau et pinces si nécessaire.
Arrêter la pompe et de transférer le cœur à un bêcher séparé rempli de solution saline tamponnée au phosphate 2X (PBS). Après que le tuyau est immergé dans la solution, la pompe démarre et augmenter le débit de 700 ml / min. Le cœur doit rester dans la solution pendant 15 min, en changeant la solution toutes les 5 min. Une variation de la pompe solution nécessite d'être arrêté temporairement tandis que les tissus et le tube est déplacéDans le bécher de nouveau.
Transfert au cœur de type I eau pendant 10 min et augmenter le débit à 750 ml / min.

3. Perfusion décellularisation et Solution

Transférer le coeur dans le bécher contenant 0,2% Trypsin/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 à 37 ° C. Augmenter la vitesse de la pompe à 1200 ml / min et démarrer la pompe. Utiliser un barreau d'agitation placé au fond du bécher pour faire circuler la solution dans le bécher. Le cœur doit rester dans le 0,2% Trypsin/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 solution à 37 ° C pour un total de trois heures. Après 1 h, augmenter la vitesse de la pompe à 1500 ml / min. Après une heure supplémentaire, augmenter la vitesse de la pompe à 1.800 ml / min. Le tissu est soumis à une lente vitesse de perfusion accrue à l'état du tissu et d'éviter la rupture des vaisseaux. Le cœur se gonfle et près du double de la taille lors de cette étape du protocole. Le tissu perd sa couleur naturelle, progressant de l'oreillette vers le sommet tout au long èmee protocole (Figure 3).
Après chaque perfusion de solution, une étape de rinçage est effectuée deux pour éliminer les débris cellulaires, résidus chimiques, et la lyse des cellules de l'aide. Chaque rinçage comprend un rinçage à 10 min de type I d'eau suivie d'un rinçage avec 10 min une solution de PBS 2X à température ambiante. Chaque lavage consiste en l'élimination de la solution du bécher originale, l'ajout des solutions de rinçage et de circulation du liquide de perfusion dans le bécher contenant le coeur immergé. Après l'0,2% Trypsin/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 solution, l'eau perfuse à 1900 ml / min, puis perfuser 2X PBS à 1950 ml / min.
Transférer le cœur à une solution de 3% de Triton X-100/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 à la température ambiante. Augmenter la vitesse de la pompe à 2.000 ml / min et la solution perfuse pendant une heure. Enlever la solution du bécher et la remplacer par une nouvelle solution, augmenter la vitesse de la pompe à 2100 ml / min, et perfuser la solution fraîche pendant une heure supplémentaire et demi, ce qui porte la durée totale en3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ à 2,5 heures.
Rincer le tissu à eau de type I à 2150 ml / min et 2X PBS au 2180 ml / min pendant 10 min à chaque fois.
Transférer le cœur à une solution de désoxycholate de sodium à 4% à la température ambiante. Augmenter la vitesse de la pompe à 2200 ml / min et la solution perfuse pendant 3 heures.
Rincer le tissu à eau de type I à X et 2X PBS à 2200 ml / min pendant 15 min à chaque fois, en changeant les solutions après 5-10 min pour chaque solution. Les étapes décrites perfusion peut être réparti sur plusieurs jours en effectuant l'étape consistant à rincer deux fois et stocker le coeur avec un tube attaché pendant une nuit à 4 ° C et immergé dans l'eau de type I.
Le lendemain, effectuer un rinçage à 5 min à eau de type I à 750 ml / min, suivi d'un rinçage 5 min dans du PBS 1X à 1500 ml / min. Le protocole peut alors être repris à la vitesse d'écoulement décrits dans la solution adéquate.

4. Désinfection et traitement final

Transfert au cœur d'un PERAC 0,1%acide étique / solution éthanolique 4% et perfuser une solution de 1,5 heure à 2.200 ml / min.
Les derniers rinçages pour les tissus sont tous effectués à 2.200 ml / min. Perfuser le tissu avec du PBS 1X pendant 15 min, suivie de deux lavages de 5 min dans de l'eau de type I. Cette série de rinçages est répété une fois de plus afin de compléter la procédure de perfusion solution.
Mettez la pompe hors tension et retirez le cœur de la solution de vider le coeur. Coupez les attaches de l'aorte, enlever tous les tuyaux, et placez le coeur dans un bécher vide égoutter pendant 1 heure. L'excès de liquide doivent être vidangés périodiquement. Posez le coeur sur un tampon absorbant afin de décharger complètement le cœur (figure 4).
Après plus de l'eau est éliminée, enregistrer le poids de la matrice extracellulaire cardiaque (C-ECM). Le cœur peut s'attendre à perdre environ 20-25% de son poids initial au cours du processus décellularisation.
Disséquer les ventricules droit et gauche, ainsi que le septum ventriculaire de l'ADN quantificatiet le traitement histologique dans le but de confirmer décellularisation complet du tissu (figure 5).
Congeler le C-ECM à -80 ° C pendant au moins 2 heures avant la lyophilisation.