Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser réticulum endoplasmique associés ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères. Cette technique implique l'perméabilisation sélective de la membrane plasmique avec de la digitonine à supprimer les contenus cytoplasmiques suivie par fluorescence In situ pour détecter soit en vrac poly (A) ARNm ou transcrits spécifiques.

Résumé

Chez les eucaryotes, la plupart des ARN messagers (ARNm) codant pour des protéines membranaires et sécrétées sont localisés à la surface du réticulum endoplasmique (RE). Cependant, la visualisation de ces ARNm peut être difficile. Cela est particulièrement vrai lorsque seule une fraction de l'ARNm est ER-associé et leur distribution à cet organite est obstrué par des non-ciblées (par exemple «libre») les transcriptions. Afin de surveiller ER-ARNm associés, nous avons développé une méthode dans laquelle les cellules sont traitées avec une courte exposition à une solution d'extraction digitonine que perméabilise sélective de la membrane plasmique, et supprime ainsi le contenu cytoplasmique, tout en maintenant l'intégrité de l'ER . Lorsque cette méthode est couplée avec hybridation fluorescente in situ (FISH), on peut visualiser clairement ER-ARNm liés par microscopie à fluorescence. En utilisant ce protocole le degré d'association pour ER-soit en vrac poly (A) relevés de notes ou ARNm spécifiques peuvent être évaluéset même quantifiés. Dans le processus, on peut utiliser ce test pour étudier la nature de l'ARNm-ER interactions.

Introduction

Chez les eucaryotes, l'ARNm codant pour les protéines membranaires et sécrétées peuvent être ciblés pour l'ER co-traductionnelle par le ^1,2 particules signal de reconnaissance et peut être maintenue sur l'urgence par le biais des interactions directes entre les ribosomes et translocons lors de la traduction ^3,4. Toutefois, si les ARNm peuvent être ciblés et maintenu sur l'examen indépendant ER soit de ribosomes ou la traduction n'était pas clair jusqu'à très récemment. Des études antérieures ont tenté de répondre s'il ya association ARNm traduction indépendante de l'ER en utilisant des techniques de fractionnement cellulaire. Parce que les conditions chimiques agressifs étaient tenus de dissocier les ribosomes de ER vésicules dérivées, ce qui pourrait potentiellement perturber le délicat ARNm-ER association, ces études n'ont pas été concluants, fournissant des preuves pour ^5-8 et contre ^9,10 ribosomique indépendante d'ancrage de l'ARNm de l'ER .

Pour contourner ces problèmes, nous avons développé un prototypecol d'isoler et d'image liés ER-ARNm. Cette procédure implique un traitement d'extraction doux, ce qui supprime efficacement tout le contenu cytoplasmique de la cellule (y compris non liés ARNm ER) tout en conservant la morphologie ER et l'ensemble de ses molécules associées. En utilisant ce protocole, nous avons démontré qu'un sous-ensemble des ARNm sont ciblées et ensuite maintenue sur l'urgence indépendamment des ribosomes ou de traduction ^11.

Protocole

1. Préparation du matériel pour l'extraction

1. Préparation de cellules
   1. Cellules de culture de tissu de semences traitées à l'acide sur des lamelles pour au moins un jour avant l'expérience. Nous utilisons COS-7 ou U2OS, étant donné que ces deux lignées cellulaires présentent une forte production de protéines sécrétées et avoir un bien défini ER. Notez que pour obtenir un rendement d'extraction élevé, les cellules ne doit pas dépasser 80% de confluence sur la lamelle sur le jour de l'expérience.
   2. Si un ARNm particulier exogène est à l'étude, les cellules sont transfectées un jour après l'ensemencement avec des plasmides contenant le gène d'intérêt en utilisant des protocoles de transfection standard. Les cellules sont ensuite autorisés à exprimer l'ARNm pendant au moins 18 heures avant l'extraction.
2. Le traitement des cellules avec des inhibiteurs de la traduction
   1. Pour tester l'effet des ribosomes intactes sur le maintien des ARNm association avec l'ER, les cellules peuvent être traitées avec des inhibiteurs de la traduction qui perturbent l'associationdes ribosomes avec l'ARNm ^11.
   2. Les inhibiteurs de la initiation de la traduction, comme homoharringtonin (VRD), pactamycin, ou 2 - (4-méthyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-méthyl-propionamide (MDMP), de prévenir de nouveaux ribosomes de s'associer avec la transcription tout en permettant aux ribosomes engagés à compléter la traduction ^12-14. Puisque le taux de traduction pour la plupart des protéines dans des cellules de mammifères est de 5 acides aminés par seconde, indépendamment de l'usage des codons ¹⁵ ou longueur d'ARNm, un traitement de 30 min doit effacer ribosomes hors de messages avec des cadres de lecture ouverts aussi longtemps que 27.000 nucléotides codant pour des protéines ( aussi longtemps que 9.000 acides aminés).
   3. Des inhibiteurs tels que la puromycine promouvoir l'éjection prématurée de la chaîne naissante et donc perturber polysomes ^12. Cependant, pour perturber complètement l'association des ribosomes puromycine traités avec l'ARNm, des chélateurs de magnésium tels que l'EDTA doit être ajouté au tampon d'extraction digitonine ^11.
   4. Dans cette expérience, les cellules sont traitées avec 200 uM puromycine, 5 uM VRD, ou moyen de contrôle pendant 30 min avant l'extraction.
3. Préparation du tampon d'extraction digitonine. Pour visualiser ER-localisées ARNm sans l'obstruction des libres (c.-à-cytoplasmiques, non-ER-associés) transcriptions, nous sélective perméabiliser la cellule avec de la digitonine, un glycoside stéroïdien qui interagit préférentiellement avec 3β-hydroxysterols. À de faibles concentrations, la digitonine perméabilise sélective des portions de la membrane plasmique, ce qui provoque «perméabilité» ^16. En revanche, la membrane du RE et de l'enveloppe nucléaire, qui sont pauvres en cholestérol, sont laissés intacts ^16,17.
   1. Digitonine (Sigma Aldrich) poudre est dissoute dans l'eau distillée à 5% du poids / volume et cette solution mère est répartie dans des petits volumes et stockés à -20 ° C. Dans notre expérience, plusieurs cycles gel-dégel diminue l'efficacité de la digitonine dissous.
   2. Une solution mère de10x tampon CHO (1x concentration de la solution de travail: 115 mm KAc, HEPES 25 mM pH 7,4, MgCl2 2,5 _mM, EGTA 2 mM et 150 mM de saccharose) est préparé avec RNase réactifs et conservés à -20 ° C. Une solution de travail (1x tampon CHO) est préparé par dilution de la solution mère avec l'eau sans RNase et peut être conservé à 4 ° C.

2. Extraction digitonine

1. Préparation des solutions d'extraction
   1. Un bloc de chauffage avec une surface plane est pré-chauffée à 40 ° C et maintenu à cette température pendant l'extraction.
   2. Pour former une surface de travail plane qui est la RNase libre, le bloc de chauffage est humidifié avec de l'eau et recouvertes avec un nouveau morceau de parafilm M (Bemis Company, Inc). Les bulles d'air entre la feuille de parafilm et le bloc de chauffage sont lissées à l'aide RNase gants et Kimwipes (VWR).
   3. 1x CHO tampon est chauffé à 37 ° C par incubation dans un bain d'eau.
   4. Plaques de 6 puits sont utilisés pour laveret fixer les cellules. Chaque rangée de 3 puits est utilisée pour une lamelle. Pour les deux premiers puits de la rangée, 2 ml de tampon CHO chauffé est ajouté. Pour le dernier puits, 2 ml de la solution de fixation (paraformaldéhyde PBS + 4% (Sciences Microscope électronique)) est ajouté. Ce plateau peut être stockée dans l'incubateur 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont prêtes pour l'extraction.
   5. Solution d'extraction digitonine est préparé par dilution de la solution de digitonine actions à 0,025% avec un tampon CHO chaude juste avant de les utiliser. Encore une fois noter que pour la puromycine cellules traitées, le tampon d'extraction doit en outre contenir 20 mM d'EDTA pour perturber efficacement ribosomes ^11. Gouttes de 100 ul de la solution d'extraction sont placés sur le bloc chauffant recouvert de parafilm immédiatement avant l'extraction.
2. Extraction digitonine et la fixation cellulaire
   1. Éliminer les cellules de l'incubateur 37 ° C.
   2. Au cours du processus d'extraction, lamelles sont manipulés avec l'aide d'une pince de Jewler. Avecla pince ramasser la lamelle et le plonger dans le premier tampon, puis le deuxième puits contenant CHO pour laver du milieu de croissance.
   3. Rapidement éponger l'excès de tampon sur le côté arrière de la lamelle avec un Kimwipe et placer immédiatement le côté pile lamelle, vers le bas, sur la solution d'extraction.
   4. Après 10 secondes, ramasser la lamelle avec la pince et le transférer immédiatement, côté pile vers le haut, pour le bien contenant le tampon de fixation paraformaldéhyde 4%.
   5. Laissez incuber l'échantillon dans un fixateur pendant au moins 15 min à température ambiante.
3. Préparation des cellules de contrôle non extrait. Pour déterminer le montant total de l'ARNm dans le cytoplasme c'est une bonne idée de préparer un échantillon de contrôle non extrait.
   1. Les cellules cultivées sur des lamelles sont préparés comme ci-dessus (voir section 2.2), sauf que l'étape d'extraction digitonine (2.2.3) est ignorée.
   2. Après fixation, les cellules non extraites doivent être perméabilisées dans du PBS + Triton 0,1%X-100 pendant 15 min à température ambiante.

3. La coloration FISH

1. Conception des sondes pour l'hybridation fluorescente in situ
   1. La séquence primaire de l'ARNm de intéressée est pliée à partir d'ARN de logiciels de prédiction de structure secondaire, telle que RNAstructure 5,0 ^18. Les plis d'ARNm sont visuellement évaluées pour identifier une région d'environ 50 nucléotides qui est exempt de grandes structures secondaires.
   2. Le complément inverse de cette région est synthétisé avec un fluorophore Alexa546 attaché à l'extrémité 5 'de la sonde (achetée chez Integrated DNA Technologies).
   3. La sonde est dilué avec de l'eau exempte de RNase à une concentration de 100 uM actions qui peuvent être conservés à -20 ° C.
2. La coloration avec sondes FISH
   1. Notez que bien que les cellules extraites digitonine ne nécessitent pas de perméabilisation plus, le traitement de ces échantillons fixes avec 2 ml de 0,1% de Triton X-100 dilué dansPBS pendant 15 min à température ambiante avant la coloration FISH, contribue à réduire le bruit de fond.
   2. Les lames sont ensuite lavées deux fois avec du PBS pour éliminer tout résidu de paraformaldéhyde ou le Triton X-100.
   3. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec 25% à 60% de formamide dans 1X tampon citrate de sodium (150 mM de NaCl et 15 mM de citrate de sodium). En général, pour les sondes FISH spécifiques qui sont de 50-60 nucléotides de long, 60% formamide est utilisé, mais pour la coloration poly ARNm (A) avec sonde oligo FISH (dT), le niveau de formamide est réduite à 25%.
   4. À préparer la chambre de coloration, le fond d'une boîte de Pétri de 150 mm est recouverte d'eau et un morceau de parafilm est introduite à l'eau. L'eau est éliminée en faisant tourner le plat fini, ce qui permet au parafilm à adhérer au fond de la boîte. Les bulles d'air sont retirés manuellement avec Kimwipes.
   5. Pour chaque lamelle à colorer, pipeter une baisse de 100 ul de la solution d'hybridation contenant la sonde FISH d'intérêt sur le nominalAFILM dans la chambre de coloration. La sonde FISH est diluée avec 25% à 60% de formamide dans le tampon d'hybridation (SSC 1x, 100 mg / ml de sulfate de dextrane, 1 mg / ml d'ARNt de levure, 5 mM de complexe riboside vanadyle, 25-60% de formamide) à une concentration de travail de 0,2 uM. Notez que la quantité de formamide doit être optimisé pour la sonde particulier qui est utilisé et est présent à la même concentration que dans la mémoire tampon de lavage SSC (voir l'étape 3.3.3).
   6. La lamelle est placée face latérale cellule vers le bas sur la solution dans la chambre de FISH coloration et incubés pendant 5-24 heures à 37 ° C dans une chambre humidifiée comme l'incubateur de culture tissulaire.
3. Lavage et le montage des échantillons colorés
   1. Pour préparer une zone de lavage RNase libre, fixer une bande de parafilm sur une surface plane, comme une table de laboratoire. Pour s'assurer que le parafilm est plat, humide, la surface plane, placez le parafilm sur le dessus et supprimer manuellement les bulles d'air avec Kimwipes.
   2. La chambre de coloration estretiré de l'incubateur et placé sur une surface plane. Les lamelles sont ensuite lancée par pipetage environ 500 pi de tampon de lavage FISH près du bord de chaque lamelle. La solution sera établi entre-deux de la lamelle et le parafilm par action capillaire.
   3. Pour chaque lamelle, 1 ml de tampon de lavage (1x CSC avec le formamide 25-60%, voir l'étape 3.3.3) est à la pipette sur la zone de lavage parafilm (voir l'étape 3.4.1).
   4. En utilisant une pince, les lamelles sont retirés de la chambre de coloration et chacun est placé sur la goutte de tampon de lavage et on fait incuber à température ambiante pendant 5 min. Le processus de lavage est répétée 3 fois.
   5. Lames de verre sont lavées avec de l'éthanol à 70% et séché avec Kimwipes.
   6. Pour chaque lamelle, 25 ul de solution de montage (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) est à la pipette sur la diapositive. Notez que cette solution contient 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), dont l'ADN des taches et permet la visualisation des noyaux.
   7. Usipince ng et Kimwipes, l'arrière de la lamelle est séché et l'excès de tampon de lavage FISH est effacé congé sans séchage de l'échantillon. Chaque lamelle est ensuite placé côté pile vers le bas, sur la goutte de solution de montage.
   8. Échantillons montés sont ensuite étiquetés et peut-être conserver à 4 ° C.

4. Imagerie et quantification

1. Imagerie
   1. Un microscope à épifluorescence est utilisé pour imager les cellules après coloration FISH. La cellule transfectée peuvent être différenciées à partir de cellules non transfectées par le signal de fluorescence brillante dans le canal approprié. Idéalement, chaque champ contient également acquis une cellule non transfectée à être utilisée pour déterminer la fluorescence de fond pour la quantification.
   2. Pour chacune des images sur le terrain de la FISH et le canal DAPI sont acquises. En outre, si les cellules sont co-colorées avec des marqueurs protéiques, une image de la chaîne d'immunofluorescence est également acquis. Noter que l'extraction de la digitonine peut également être utiliséde visualiser ER ribosomes liés aux protéines et ^11.
   3. Faire en sorte que les intensités de fluorescence entre les champs peuvent être comparés, le temps d'exposition pour chaque canal doit rester constante pour chaque ensemble de l'expérience.
   4. Encore une fois afin de s'assurer que les intensités de fluorescence entre les cellules sur des lamelles différents peuvent être comparés, les changements au jour le jour dans l'intensité épiluminescence ou de pourriture dans le signal FISH doit être minimisée par l'imagerie par tous les lamelles en une seule séance.
2. Quantification. Pour quantifier la quantité d'ARNm qui est localisée sur l'urgence, nous utilisons un logiciel Nikon élément NIS. Cependant d'autres logiciels d'analyse d'image, comme ImageJ peut être utilisé.
   1. Utilisation de l'outil de Nikon NIS ELEMENT analyse d'image, la périphérie de la cellule et le noyau sont décrits ci-région distincte des intérêts (ROI).
   2. Pour chaque ROI, l'intensité de fluorescence (I _T pour l'intensité totale des cellules et je _n pour lesl'intensité nucléaire) et la zone (A et _T A _N) sont enregistrés et exportés vers un tableur Excel.
   3. Pour chaque image, l'intensité de fluorescence de fond (I _B) est déterminée par l'enregistrement de l'intensité d'une cellule non transfectée. Si les niveaux d'ARNm poly (A) sont en cours d'analyse, une zone exempte de cellules est sélectionnée.
   4. La quantité totale de ER (dans les cellules extraites) ou cytoplasmique (dans les cellules non extraits) de fluorescence est calculé par la formule:
      [A _{T] [T} I - I _B] - [A _{N] [N} I - I _B]
   5. L'intensité de la coloration nucléaire peut également être calculé et utilisé comme contrôle interne entre les différents traitements. Depuis les noyaux ne sont pas affectés par le traitement digitonine ¹⁷ ou la perturbation des ribosomes ^11, la quantité d'ARNm nucléaire doit rester constante entre chacun de ces traitements. Pour calculer une fluorescence nucléaire de la formule suivante est utilisée:
      [A _{N] [N} I - IB]
   6. Le pour cent de l'ARNm cytoplasmique qui est ER ciblée peut être calculé en prenant la moyenne de fluorescence ER de 30-40 cellules extraites (voir 4.2.4) divisée par la fluorescence cytoplasmique moyenne de 30 à 40 cellules (non extraits à nouveau voir 4.2.4) . Il est essentiel que les cellules extraites et non extrait sont préparés, colorées et imagées en parallèle.

Résultats

Pour déterminer le pourcentage d'ARNm qui est associé ER-, COS-7 cellules qui ont été transfectées avec des plasmides qui contiennent de la phosphatase alcaline placentaire (zone à faible prévalence) ou le cytochrome P450 8B1 (CYP8B1) ont été soit extrait avec de la digitonine, puis fixé ou fixé directement (voir la figure 1, comparer "non extrait Ctrl" pour "Extrait Ctrl"). La fluorescence non nucléaire a été quantifiée dans les deux échantillons et la fraction de ER-associé ARNm a ét...

Discussion

La localisation des ARNm vers divers sites subcellulaires, grâce à l'interaction avec les protéines de la transcription d'ARNm de localisation, est un phénomène répandu important pour le tri correct des protéines vers leur destination finale, et pour le réglage fin de l'expression génique aux exigences locales d'un subcellulaire ^19,20 région.

En utilisant le test décrit ici, nous avons réexaminé la question de savoir si les ARNm qui codent pour des protéines de séc...