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Article de méthode

En temps réel l'imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

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DOI :

10.3791/50076

⸱

23 juin 2013

 ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode d'imagerie des cellules vivantes qui donne un aperçu de la dynamique des protéines au cours du processus d'activation des lymphocytes T. Nous démontrons l'utilisation combinée de la cellule T test d'épandage, microscopie confocale et analyse d'imagerie pour obtenir des résultats quantitatifs à suivre la signalisation formation du complexe à travers l'activation des lymphocytes T.

Résumé

Protection contre les maladies infectieuses est médiée par le système immunitaire de 1,2. Les lymphocytes T sont des coordinateurs de base du système immunitaire, la régulation de l'activation et de réponses des cellules immunitaires multiples 3,4. Activation des lymphocytes T est fonction de la reconnaissance des antigènes spécifiques affichés par des cellules présentatrices d'antigène (CPA). Le récepteur de l'antigène des cellules T (TCR) est spécifique à chacun des clones de cellules T et détermine la spécificité antigénique 5. La liaison du TCR à l'antigène induit la phosphorylation des composants du complexe TCR. Afin de promouvoir l'activation des lymphocytes T, ce signal doit être transduction de la membrane vers le cytoplasme et le noyau, initiant diverses réponses cruciales telles que le recrutement de protéines de signalisation à la TCR, le site APC (la synapse immunologique), leur activation moléculaire, réarrangement du cytosquelette, l'élévation de la concentration de calcium intracellulaire, et les changements dans l'expression des gènes 6,7. L'exactitude deitiation et la cessation des signaux d'activation est essentielle pour les réponses des lymphocytes T appropriés. L'activité des protéines de signalisation dépend de la formation et de cessation des interactions protéine-protéine, modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation des protéines, la formation de complexes protéiques, ubiquitylation de protéines et le recrutement de protéines à différents sites cellulaires 8. Comprendre les rouages ​​du processus d'activation des lymphocytes T est crucial tant pour la recherche immunologique et les applications cliniques.

Différents tests ont été développés afin d'étudier les interactions protéine-protéine, mais dosages biochimiques, comme la méthode de co-immunoprécipitation largement utilisé, ne permettent pas lieu de protéines pour être discernée, empêchant ainsi l'observation des indications précieuses sur la dynamique du cellulaire des mécanismes. En outre, ces essais en vrac combinent habituellement des protéines de nombreuses cellules différentes qui pourraient être à différents stades de til a étudié processus cellulaire. Cela peut avoir un effet néfaste sur la résolution temporelle. L'utilisation de l'imagerie en temps réel des cellules vivantes permet à la fois le suivi spatial des protéines et la capacité de distinguer temporellement entre les événements de signalisation, donc faire la lumière sur la dynamique du processus de 9,10. Nous présentons une méthode d'imagerie en temps réel de formation de signalisation complexe lors de l'activation des lymphocytes T. T-cellules primaires ou de lignées de cellules T, telles que Jurkat, sont transfectées avec des plasmides codant pour des protéines d'intérêt fusionnées à des protéines fluorescentes monomères, empêchant oligomérisation non physiologique 11. Vivre les cellules T sont déposés sur une lamelle couvre-objet pré-enduit avec un anticorps d'activation des cellules T 8,9, qui se lie au complexe CD3/TCR, induire l'activation des cellules T, tout en surmontant la nécessité d'antigènes d'activation spécifiques. Les cellules activées sont constamment imagés à l'utilisation de la microscopie confocale. données d'imagerie sont analysés pour donner des résultats quantitatifs, tels que le colcoefficient de ocalization des protéines de signalisation.

Protocole

1. La transfection des cellules T

  1. Préparer la solution activée Amaxa Nucleofector en mélangeant le "Supplément" la solution du kit à la Solution Nucleofector. La solution activée peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à trois mois.
  2. Cultiver des cellules T Jurkat dans le milieu de culture [10% sérum de veau foetal (FCS), une solution de pénicilline-streptomycine de 1% et 2 mM de L-glutamine dans RPMI]. Idéalement, les cellules doivent être utilisées 1-2 semaines après la décongélation. En utilisant des cultures de cellules en croissance logarithmique est cruciale pour l'efficacité de transfection élevée et la survie cellulaire. Sinon, avec des modifications mineures, ce protocole peut être utilisé avec des cellules T primaires, comme décrit précédemment 8. Il convient de souligner que la durée du processus d'activation des cellules T primaires est plus longue que celle des cellules T Jurkat (~ 30 min), une platine de microscope monté système d'incubation doit être utilisé pour maintenir le CO 2, le taux d'humidité et la température dans le processus d'activation.
  3. Collecter 5× 10 6 en phase logarithmique des cellules T par transfection dans un tube de 15 ml.
  4. Centrifuger les cellules pendant 7 min à 400 g à température ambiante.
  5. Lors de la centrifugation, préparer une plaque à 6 puits. Remplir un puits pour chaque transfection avec un milieu de culture de 5 ml, et les pré-incuber à 37 ° C.
  6. Recueillir les tubes de la centrifugeuse et jeter le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 1 ml de RPMI.
  7. Centrifuger les cellules pendant 7 min à 400 g à température ambiante.
  8. Lors de la centrifugation, de préparer la solution de transfection. Dans un puits d'une plaque de 96 puits, mélanger activé 100 ul solution Nucleofector Amaxa préparé à l'étape 1 avec 5 pg d'ADN du plasmide d'intérêt codant pour une protéine fluorescente marquée. De manière optimale, la concentration de l'ADN doit être supérieur à 1 pg / ml dans le but d'éviter la dilution de la solution de transfection.
  9. Bien mélanger par pipetage doux.
  10. Après centrifugation des cellules, enlever soigneusement tout le surnageant alors pas disturbing la pastille.
  11. Pipeter deux fois la solution d'ADN / de transfection.
  12. Ajouter la solution d'ADN / de transfection de la pastille.
  13. Transférer les cellules à la Amaxa cuvette.
  14. Insérez la cuve dans l'appareil Nucleofector Amaxa.
  15. Utilisez le réglage H-10 Amaxa transfection pour l'électroporation (pour Jurkat) ou T-23 (pour les cellules T primaires).
  16. Retirer la plaque de 6 puits de l'incubateur.
  17. Après l'électroporation, transfert de soin le surnageant de la suspension cellulaire de la plaque à 6 puits à l'aide d'une pipette Pasteur. Un culot constitué de débris de cellules peut se former. Éviter de transférer le culot.
  18. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C.
  19. Transférer 2,5 ml de suspension de cellules à partir de chaque puits dans un nouveau puits. Ajoutez milieu de culture chaud de 2,5 ml (décrite à l'étape 2) à chaque puits.
  20. Après 72 heures, transférer les cellules dans un tube stérile et centrifuger pendant 7 min à 400 g à température ambiante. Jeter le surnageant et le remplacer wiMilieu de culture ème supplémenté avec l'antibiotique de sélection de cellules de mammifère approprié pour le plasmide utilisé (appliquer une concentration appropriée pour les antibiotiques utilisés; nous avons utilisé G418 et / ou l'hygromycine à des concentrations de 1,3 mg / ml et / ou de 0,2 mg / ml, respectivement). Culture de la suspension cellulaire dans un nouveau puits. Alternativement, les cellules peuvent être transfectées de façon transitoire et imagés 48 heures après transfection. Pour préparer les cellules transfectées de façon transitoire, co-transfection des cellules avec les deux plasmides simultanément à l'étape 8, en continuant normalement à l'étape 20, puis passez directement à l'étape 23. Notez que dans ce scénario, les cellules doivent être utilisées immédiatement, et généralement leur intensité de fluorescence est hétérogène et pas nécessairement élevé.
  21. Cultiver les cellules avec du milieu de culture supplémenté avec l'antibiotique de sélection approprié. Fractionner les cellules et les compléter avec un milieu de culture antibiotiques complétée au besoin.
  22. Après 2 semaines, vérifier transfection réussie avec l'utilisation de FACS (grippele tri de cellules activé par orescence) comme suit:
  23. Recueillir 10 6 cellules transfectées, 10 6 cellules transfectées à blanc (contrôle négatif), et 10 6 cellules qui sont connus pour exprimer de façon stable la protéine fluorescente marquée. Si les cellules sont transfectées avec plus d'une protéine fluorescente (voir l'étape 27), utiliser plusieurs lignées cellulaires, individuellement étiquetés comme contrôles positifs.
  24. Centrifuger les cellules pendant 7 min à 400 g à température ambiante.
  25. Jeter le surnageant. Remettre les cellules dans 500 pi de tampon FACS (PBS w / o Ca 2 + et Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% d'azoture de sodium).
  26. Utiliser un FACS analyse pour vérifier fluorescence cellulaire. Comparer la fluorescence des cellules transfectées à celle des témoins négatifs et positifs.
  27. Pour transfecter des cellules avec un supplément de protéines marquées par fluorescence, répéter les étapes 3 à 26 en utilisant des cellules transfectées.
  28. Cellules présentant des niveaux élevés de fluorescence doivent être utilisés. De manière optimale, au moins 50% deles cellules de la culture doit être fortement fluorescent. fluorescence cellulaire peut être augmentée par tri cellulaire par FACS.

Toutes les protéines marquées supplémentaires doivent être fusionnés à des fluorophores différents et être codées par des plasmides codant pour les différents antibiotiques de sélection. moyen de sélection pour les cellules transfectées avec plus d'un plasmide doit être complétée par l'ensemble des antibiotiques appropriés.

2. T-cell épandage Assay Preparation

  1. Utilisez Lab-Tek II système lamelle allemand 4 diapositives de chambre. Veillez à ne pas rayer accidentellement la surface intérieure des chambres, par exemple, avec une pointe de pipette, lors de la préparation ou de l'utilisation.
  2. Préparer une solution de préparation toboggan de 50 ml: Prendre 4,6 ml de 12 M (37%) HCl, ajouter 38,5 ml d'éthanol à 100%, et de 6,9 ​​ml d'eau bidistillée.
  3. Remplir chaque chambre de la diapositive avec 500 ul solution de préparation des lames.
  4. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  5. Aspirer la chambres, de les sécher complètement.
  6. Incuber les lames à découvert pendant 1 h à 45 ° C jusqu'à séchage complet.
  7. Préparez 0,01% solution de poly-L-lysine par dilution de 0,1% de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) dans de l'eau bidistillée.
  8. Appliquer 500 ul à chaque chambre.
  9. Incuber la lame pendant 15 min à température ambiante.
  10. Aspirer les chambres, les sécher complètement.
  11. Incuber pendant 3 heures à 45 ° C jusqu'à séchage complet.
  12. Lames revêtues peuvent être stockés au sec pendant plusieurs mois à température ambiante.
  13. Préparer une solution d'anticorps d'activation. Utilisez un anticorps anti-CD3: soit HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) ou UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml dans 400 pi de PBS, par chambre. Cette solution doit être préparée peu avant la préparation des lames.
  14. Remplir chaque chambre avec 400 ul de la solution d'anticorps activant.
  15. Incuber la lame pendant 2 heures à 37 ° C ou, de préférence, une nuit à 4 ° C.
  16. Retirez le déclenchement anticorps solution et laver immédiatement la chambre deux fois avec 300 pi de PBS. De ce point, assurez-vous que les chambres restent remplis avec le tampon.
  17. Rangez la diapositive PBS-rempli à 4 ° C. Nous vous suggérons d'utiliser les chambres de diapositives préparées dans 1 semaine.

3. L'activation des lymphocytes T et d'imagerie

  1. Préparer tampon imagerie [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml de FCS, 38,75 ml de RPMI sans rouge de phénol]. Tampon Imaging peut être conservé à 4 ° C après filtration.
  2. Activer le Zeiss LSM 510 Meta microscope. Chauffer le cadre de montage pouvant être chauffé de microscope à 37 ° C. Sélectionnez mode "Expert".
  3. Cliquez sur l'onglet "Acquérir" et ouvrez les onglets suivants: les lasers; Microscopie; configuration; numérisation; séries chronologiques.
  4. Activer les lasers nécessaires. Pour l'excitation de MCFP et mYFP, réglez le Argon / 2 laser de "veille" pendant 5 min, puis sur "on".
  5. Si vous avez effectué ce test d'imagerie des cellules vivantes avant, en utilisant les mêmes fluorophores, ouvrez le fichier LSM apparaît, cliquez sur la "réutilisation" icon, et reprenez à l'étape 9. Sinon, poursuivez à l'étape 6.
  6. Définir des canaux à l'aide de filtres appropriés pour l'excitation et l'émission des protéines fluorescentes utilisées.
  7. Dans la fenêtre «Scan de contrôle", sélectionnez l'option de la pile Z.
  8. Entrez les paramètres de numérisation suivants: Nombre de tranches: 5; Intervalle: 0,5 um; tranche actuelle: 3.
  9. Préparer un bain numérique sec Accublock (Labnet) à 37 ° C près du microscope.
  10. Chauffer le tampon d'image à 37 ° C.
  11. Préparer la diapositive stockées par l'aspiration du PBS, le remplaçant par 600 pi de tampon d'imagerie chaud.
  12. Incuber la lame à 37 ° C. Gardez la lame dans l'incubateur jusqu'à l'étape 13, pendant au moins 15 min.
  13. Collecter 5 × 10 5 cellules T transfectées.
  14. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 400 x g.
  15. Jeter le surnageant.
  16. Remettre les cellules dans un tampon d'imagerie chaude 1 ml, et de les transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
  17. Placez le tTube intérêts sur le Accublock Bain à sec numérique.
  18. Prenez la lame chauffée de l'incubateur, et le monter sur le cadre de montage de microscope réchauffé.
  19. Cliquez sur l'icône "VIS".
  20. Mélanger la suspension cellulaire et retirer 1-2 pl.
  21. Insérer la pointe de la pipette dans la mémoire tampon d'image au-dessus du fond de la glissière. Évitez de vous gratter la diapositive.
  22. Ensemencer les cellules sur le diaphragme de l'objectif.
  23. Immédiatement commencer à suivre visuellement les cellules fluorescentes comme ils descendent. Sélectionnez une cellule qui affiche une grande fluorescence dans les deux canaux.
  24. Avant la cellule atteint la surface de la lame, activer le mode LSM.
  25. Basculer seul laser d'excitation. Sélectionner un laser pour lequel vous avez un canal DIC.
  26. Réglez le zoom à 1. Cliquez sur l'icône "Fast XY". Cliquez sur l'icône "Stop". Utilisation de l'outil de recadrage, sélectionnez un retour sur investissement centré sur la cellule.
  27. Réglez le zoom sur 3. Cliquez sur l'icône "Fast XY", puis régler manuellement la mise au point de voir de manière optimale la cellule. Cliquez sur le "Stop" icon.
  28. Basculer tous les lasers d'excitation nécessaires.
  29. Commencez l'enregistrement en cliquant sur l'icône "Startt". L'image de la cellule pour l'ensemble du processus d'étalement (communément 5 min). Lorsque vous avez terminé, cliquez sur l'icône "Stop".
  30. Enregistrez le fichier.
  31. Pour acquérir des cellules supplémentaires, cliquez sur l'icône "VIS". Si il ya des cellules qui n'ont pas encore entré en contact avec le fond de la diapositive, reprenez à l'étape 23. Évitez l'imagerie de cellules qui ont déjà commencé le processus de propagation. Sinon, passez à l'étape 32.
  32. Si la zone de diapositive observée est essentiellement dépourvue de cellules, ajouter une autre aliquote de cellules (reprenez à l'étape 20). Sinon, passez à l'étape 33.
  33. Pour acquérir des cellules supplémentaires, déplacer le chariot de sorte que la zone au-dessus de l'ouverture de l'objectif est dépourvue de cellules.
  34. Ajouter une autre aliquote de cellules (et continuent de l'étape 20).
  35. Après avoir effectué toutes les images souhaité, ouvrez un fichier LSM sauvé.
  36. Cliquez sur "Galerie", "Time + Z" et "sous-ensemble".
  37. Sélectionnez la pertinent de plage de temps et Z pile.
  38. Enregistrez le nouveau fichier.
  39. Effectuer les étapes 35-38 pour tous les fichiers d'imagerie.

4. L'analyse des données d'imagerie

  1. Ouvrez les fichiers de LSM en utilisant le logiciel Imaris (Bitplane AG, Zurich Suisse).
  2. Cliquez sur "surpasser". Cliquez sur le menu «Image Processing", et sélectionnez "Swap Temps et Z". Cela aidera à la culture correcte de l'image.
  3. Cliquez sur la barre d'outils "Edition" et sélectionnez l'option «3D des cultures" dans le menu déroulant. Recadrer l'image afin d'inclure uniquement la zone entourant la cellule. Nous vous suggérons de culture une place de 300 × 300 pixels centré sur la cellule. Notez que la forme et l'emplacement de la cellule peuvent changer au fil du temps. Constatant l'axe t, assurez-vous que la cellule est dans la région découpée en tous points dans le temps.
  4. Cliquez sur le menu «Image Processing", et sélectionnez "Swap Temps et Z" pour rétablir la séparation temporelle originale de l'image.
  5. Appuyez sur le bouton "Coloc" dans la barre d'outils principale. Sélectionnez l'option "Créer Heure Dep. Coloc ". Imaris calcule automatiquement les seuils d'intensité pour chaque canal à chaque point de temps.
  6. Voir les résultats de l'analyse de colocalisation en sélectionnant «Statistiques Channel". Exporter les données en cliquant sur "Exporter".
  7. Répétez les étapes 1 à 6 pour chaque cellule imagé. Nous recommandons au moins 50 cellules seront analysées de cette manière.
  8. Calculer le coefficient moyen de co-localisation de Pearson et son erreur ou déviation standard.

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Résultats

Nous présentons un exemple de l'imagerie des cellules T et l'analyse en direct. Avant l'expérience d'imagerie, SLP76 cellules T déficientes (J14) ont été analysés à l'aide de FACS pour déterminer l'expression des protéines fluorescentes (Figure 1). Les cellules T transfectées avec les protéines de signalisation marqués MCFP-NCK et SLP76-mYFP ont été déposés sur des diapositives activation et imagés au cours de T-étalement cellulaire (Figure 2). Images recueillies...

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Discussion

La régulation et la fonction des multiples processus cellulaires dépendent de la formation et de cessation des interactions protéine-protéine. Imagerie microscopique permet le suivi en temps réel des protéines marquées par fluorescence dans les cellules vivantes. Colocalisation de protéines marquées peut suggérer une interaction directe ou indirecte entre les protéines, et peut être utilisée pour renforcer les résultats obtenus par des méthodes biochimiques, comme immunoprécipitation. Contrairement aux méthodes biochimi...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons pas de conflits d'intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs remercient Sophia Fried pour l'assistance technique. MBS remercie les organismes suivants pour leur soutien à la recherche: La Fondation Israël science des subventions no.1659/08, 971/08 1503/08 et 491/10, les ministères de la Santé et sciences de subventions aucun. 3-4114 et 3-6540, l'Association israélienne du cancer à travers la succession de feu Alexander Smidoda, et la Fondation de la famille Taubenblatt pour la bourse d'excellence Bio-médecine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactif/Matériel
Amaxa kit de nucléofecteur de cellules T humainesLonzaVCA-1002
Anti CD3 (clone UCHT1) BioLegend300432
Falcon FACIS TubesBecton Dickinson352058
FCSHyCloneSV30160.03
G418Calbiochem345810
Système de recouvrement allemand 4 lames de chambre Lab-Tek II155382
HClBio Lab8410501
Hepes Biological Industries03-025-1B
HygomycineEnzoALX-380-306
L-glutamine SigmaG7513
PBS (10X)SigmaD1408
Pénicilline-Streptomycine SigmaP0781
Poly-L-lysine 0,1 % (p/v) dans H2OSigmaP8920
RPMISigmaR87589
Azoture de sodiumSigmaS2002
Equipment
Accublock digital dry bathLabnetD1105A
CentrifugeuseEppendorfCentrifuge 5810 R
Microscope confocalZeissLSM 510 Meta
Cadre de montage chauffant - Insert chauffant P S PeCon130-800-031
TempModule S (nécessaire pour le cadre de montage chauffant)Zeiss411860-9010-000
Appareil d’électroporationAmaxaNucleofector I
Trieur de cellules activé par fluorescenceBecton DickinsonFACSVantage SE
Logiciel d’analyse d’imagesBitplane7.0.0

Références

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  18. Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3(2012).

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