L&#39;analyse de l&#39;accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em&gt; Cueilleur rayado fino virus</em&gt; Virus-like particles produits dans<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantes et réticulation des peptides à VLP

Résumé

Procédé pour analyser l'accessibilité au solvant du groupe thiol de résidus cystéine de Cueilleur rayado fino virus (MRFV)-particules de type virus (VLP) suivi d'un peptide réaction de réticulation est décrit. La méthode tire parti de la disponibilité de plusieurs groupes chimiques à la surface des particules de type viral qui peuvent être les cibles de réactions spécifiques.

Résumé

Imitant et l'exploitation de propriétés du virus et les caractéristiques physico-chimiques et physiques promet d'apporter des solutions à certains des défis les plus urgents de la planète. La multitude et les types de virus associés à leurs propriétés intrigantes potentiellement donner des possibilités infinies pour les applications dans les technologies à base de virus. Les virus ont la capacité de s'auto-assembler en particules de forme discrète et la taille, la spécificité de symétrie, la polyvalence, et des propriétés stables dans une large gamme de conditions de température et de pH. Sans surprise, avec une gamme remarquable de propriétés, les virus sont proposés pour être utilisés dans les biomatériaux ^{9, 14, 15} vaccins, du matériel électronique, des outils et des produits chimiques, l'électronique moléculaire conteneurs ^{4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12.}

Afin d'utiliser les virus dans les nanotechnologies, elles doivent être modifiées de leurs formes naturelles pour donner de nouvelles fonctions. Ce défi processus peut être réalisée par plusieurs mécanismes comprenant la modification génétique du génome viral et la fixation chimique des molécules étrangères ou souhaitée pour les groupes réactifs des particules virales ^8. La possibilité de modifier un virus dépend essentiellement des propriétés physico-chimiques et physiques du virus. En outre, les modifications génétiques ou physico-chimique doivent être effectuées sans affecter la structure du virus indigène et le fonctionnement du virus. Protéines de maïs rayado fino virus manteau (MRFV) s'auto-assembler dans Escherichia coli produisant des VLP stables et vides qui sont stabilisées par protéine-protéine interactions et qui peut être utilisé dans les applications des technologies à base de virus ^8. VLP produites dans des plants de tabac ont été examinés comme un échafaudage sur lequel une variété de peptides peuvent être affichés de manière covalente ^13. Ici, nous décrivons les étapes 1) à déterminer lequel des cystéines accessibles au solvant dans une capside du virus sont disponibles pour les modification, et 2) Bioconjugate peptides modifiés pour les capsides. En utilisant indigènes ou par mutation-inséré résidus d'acides aminés et des standards des technologies de couplage, une grande variété de matériaux ont été affichées sur la surface des virus de plantes tels que le virus de la mosaïque de Brome ^3, virus de la panachure Carnation ^12, niébé virus de la marbrure chlorotique ^6, la mosaïque du tabac virus ^17, virus de la mosaïque jaune navet ^1, et MRFV ^13.

Protocole

1. Inoculation et purification de virus VLP de plantes de Nicotiana benthamiana

1. Produire plafonnées T7-ARN transcrits à partir de pommes de terre du virus X (PVX) à base de plasmides vecteurs transportant MRFV de type sauvage (wt) et protéine d'enveloppe Cys-muté (CP) des gènes ^12, en utilisant Ambion de T7-mMessage mMachine Kit.
2. Pour chaque réaction transcription T7, inoculer deux feuilles complètement développées de N. benthamiana avec 10 pi de réactions et incuber les plantes pendant 10 jours en serre à 60% d'humidité pendant 16 heures avec de la lumière (25.000-30.000 lux) à 25 ° C et 8 h obscurit....

Résultats

L'expression transitoire de mutants MRFV manteau de protéines (CP) des gènes dans N. benthamiana dans un vecteur PVX VLP à base produisant est décrit dans la figure 1. Le gène modifié MRFV protéine d'enveloppe est amplifié par PCR puis placé sous le contrôle transcriptionnel du promoteur subgénomique CP dupliqué dans un vecteur PVX-base, pP2C2S ^2, (un cadeau de D. Baulcombe, Laboratoires Sainsbury, Norwich, Angleterre). En vitro transcription de l'ARN produit de .......

Discussion

La méthode présentée ici permet une analyse très sensible et rapide de cystéines réactives présentes sur la surface de particules de type viral de plantes produites ainsi que tous les autres complexes protéiques. Maléimides sont thiol-spécifique des réactifs, qui réagissent avec sulfhydryle libres des molécules contenant de former des liaisons thioéther stable. Cette méthode s'appuie sur la spécificité des maléimides à réagir avec des groupes sulfhydryle pas impliqués dans les interactions avec d'autres acides a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Thinwall, Ultra-Clear Tubes	Beckman	344059
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit	Tecnologies vie	AM1344M
Fluorescéine-5-maléimide	Thermo Scientific Technologies de la vie	46130 F150	46130 est hors de substitution afin d'F150
Kit de quantification Pierce biotine	Thermo Scientific	28005
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotine, Non-Weigh Format	Thermo Scientific	21901
SM (PEG) n Réticulants	Thermo Scientific	22107
10-20% de Tris-Glycine gel	Invitrogen	EC61352
Tampon Laemmli	Bio-Rad	1610737
Tris Glycine SDS Exécution tampon	Invitrogen	LC2675
Tris Glycine transfert Tampon	Invitrogen	LC3675
Membrane de nitrocellulose papier filtre Sandwich	Invitrogen	LC2001
Affinity phosphatase marqué anticorps purifiés à IgG de lapin	Kirkegaard et Perry Laboratories	0751516
Substrat de la phosphatase NBT / BCIP	Kirkegaard et Perry Laboratories	508107