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Article de méthode

Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

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DOI :

10.3791/50117

⸱

9 novembre 2012

 ,  , 
1Department of Physics, Lawrence University

Dans cet article

Résumé

Procédé pour mesurer la longueur de persistance ou la rigidité en flexion de biopolymères est décrit. La méthode utilise une kinésine axée sur les microtubules glisse test pour déterminer expérimentalement la longueur de persistance des microtubules individuels et est adaptable à l'actine des essais à base de glisse.

Résumé

Les microtubules sont des polymères du cytosquelette qui jouent un rôle dans la division cellulaire, mécanique cellulaire et le transport intracellulaire. Chacune de ces fonctions nécessite microtubules qui sont raides et droites assez pour couvrir une fraction significative du diamètre cellulaire. En conséquence, la longueur de persistance des microtubules, une mesure de rigidité, a été activement étudiée pour les deux dernières décennies 1. Néanmoins, des questions restent ouvertes: microtubules courts sont 10-50 fois moins rigide que les microtubules longues 2-4, et même microtubules longs ont mesuré la longueur de persistance qui varient d'un ordre de grandeur 5-9.

Ici, nous présentons une méthode pour mesurer la longueur de persistance des microtubules. La méthode est basée sur une analyse axée sur la kinésine microtubules glisse 10. En combinant rares marquage fluorescent des microtubules individuels avec suivi de particule unique de fluorophores individuelles attachées à des microtubules, le Glidintrajectoires g de microtubules simples sont suivis du nanomètre-niveau de précision. La longueur de persistance de la trajectoire est la même que la longueur de persistance de l'microtubules dans les conditions utilisées 11. Un sous-programme de suivi automatisé est utilisé pour créer des trajectoires des microtubules à partir de fluorophores liés aux microtubules individuels, et la longueur de persistance de cette trajectoire est calculée à l'aide des routines écrites en langage IDL.

Cette technique est rapidement réalisable, et capable de mesurer la longueur de persistance de 100 microtubules dans un jour de l'expérimentation. La méthode peut être étendue pour mesurer la longueur de persistance sous une variété de conditions, y compris la durée de persistance en fonction de la longueur le long des microtubules. En outre, les routines d'analyse utilisés peuvent être étendus à la myosine à base de tests effet de glisse, pour mesurer la longueur de persistance des filaments d'actine ainsi.

Introduction

Le cytosquelette, un réseau de biopolymères présent dans la plupart des cellules eucaryotes, joue un rôle dans l'organisation cellulaire, le transport intracellulaire et la mécanique cellulaire. Les caractéristiques mécaniques des biopolymères du cytosquelette (principalement l'actine et les microtubules) jouent un rôle important dans la détermination des caractéristiques mécaniques de la cellule dans son ensemble12. Puisque la mécanique de la cellule entière permet de caractériser les cellules saines et malades13,14 et est impliquée dans la motilité cellulaire15, les propriétés mécaniques des composants cytosquelettiques sous-jacents font l'objet d'études approfondies depuis deux décennies1.

La flexibilité (ou rigidité) des biopolymères est caractérisée par la longueur de persistance, qui correspond à la longueur de polymère se courbant d’environ un radian sous l’effet des fluctuations thermiques à température ambiante. Plusieurs techniques ont été mises au point pour mesurer la longueur de persistance16, par exemple des techniques actives impliquant la déformation du polymère à l’aide d’un écoulement hydrodynamique, de pièges optiques ou de champs électriques4,17,18, ainsi que des techniques passives mesurant les fluctuations de polymères libres en solution5,6. Les mesures actives nécessitent toutefois des dispositifs spécialisés permettant d’appliquer des forces connues à l’échelle micrométrique, tandis que les mesures de fluctuations libres peuvent s’avérer difficiles en raison de la diffusion hors du plan de mise au point du microscope utilisé.

Dans cet article, nous décrivons une technique complémentaire et passive permettant de mesurer la longueur de persistance des microtubules, un polymère du cytosquelette. La technique repose sur des essais de glissement, qui garantissent que le polymère reste toujours dans le plan focal19. De plus, elle implique le suivi de fluorophores uniques fixés de manière permanente au polymère d'intérêt, de sorte que des emplacements spécifiques le long du polymère soient bien caractérisés.

Un schéma de la méthode est présenté dans Figure 1. La kinésine se déplace spécifiquement vers l'extrémité + des microtubules, de sorte que les microtubules dans un test de glissement sont propulsés de manière unidirectionnelle. L'extrémité avant du microtubule, au-delà de la dernière kinésine attachée, est libre de fluctuer sous l'effet des forces thermiques de la solution environnante. Lorsque le microtubule est propulsé vers l'avant, cette extrémité fluctue jusqu'à ce que sa liaison avec une nouvelle molécule de kinésine située plus loin sur la lame de verre fige une fluctuation donnée. Étant donné que la kinésine fixe les microtubules très fortement, le microtubule est contraint de suivre le trajet de son extrémité avant. Ainsi, les fluctuations statistiques figées dans la trajectoire du microtubule sont identiques aux fluctuations statistiques de l'extrémité libre des microtubules11, et peuvent donc être utilisées pour calculer la longueur de persistance selon20

Équation d'équilibre statique ; ⟨cosθ_s⟩=e^(-s/l_p). Formule pour l'analyse scientifique.
où lp est la longueur de persistance du microtubule, θs est l'angle entre les tangentes à la trajectoire séparées par une longueur curviligne s, et <> désigne une moyenne effectuée sur toutes les paires de positions séparées par une longueur curviligne s.

Le test de glissement utilise une kinesine biotinylée au niveau du domaine en hélice enroulée21, fixée spécifiquement sur la lame de verre par un lien streptavidine-biotine. Cette fixation garantit que les domaines moteurs restent libres pour se lier aux microtubules et les propulser. Afin de suivre les trajectoires des microtubules, ceux-ci sont marqués de manière clairsemée par des fluorophores organiques22,23 — le marquage doit être suffisamment dilué pour que chaque fluorophore individuel puisse être résolu par microscopie de fluorescence monocellulaire. Les fluorophores uniques sont suivis à l’aide de programmes d’analyse d’image écrits en IDL. Les trajectoires de chaque fluorophore lié à un microtubule donné sont automatiquement combinées en une trajectoire composite du microtubule24. Les angles tangentiels θ en chaque point d’une trajectoire sont calculés ; à partir de ces angles tangentiels, la valeur <cosθs> est déterminée pour chaque longueur curviligne s. Enfin, ces données sont ajustées selon l’équation 1 afin d’obtenir la longueur de persistance d’un microtubule donné, ou de plusieurs microtubules issus du même test de glissement.

La méthode est suffisamment robuste pour fonctionner avec des microtubules préparés dans une grande variété de conditions (avec différents agents stabilisants ou autres petites molécules liées au microtubule, avec des protéines associées aux microtubules (MAPs) liées, ou dans diverses solutions visqueuses). Dans notre laboratoire, cette technique a été utilisée pour caractériser la longueur de persistance des microtubules en fonction de leur longueur et des microtubules contenant différents agents stabilisants. La principale restriction est que les microtubules doivent encore permettre la motilité de la kinésine. Étant donné que la kinésine est une enzyme motrice robuste, cette restriction est relativement faible. En remplaçant les microtubules par de l’actine et la kinésine par une enzyme de la famille de la myosine, la longueur de persistance de l’actine peut être mesurée à l’aide de la même technique.

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Protocole

1. Microtubules vol à voile Assay Solutions mères

Préparer à l'avance de dosage glisse.

  1. Polymériser 0,5 mg microtubules peu marquées avec un fluorophore organique lumineuse 22. La concentration étiquette cible est de 1 fluorophore par micromètre de microtubules, soit une densité étiquetage d'environ 1 fluorophore par 1.500 dimères de tubuline. Entreposer à la température ambiante, la lumière protégée avec de l'aluminium, une feuille pour un maximum de deux semaines.
  2. Purifier biotine-kinésine 21 à environ 1 uM. Conserver à -80 ° C en 5 aliquotes pour utilisation dans des expériences individuelles.
  3. Préparer le tampon de dosage (AB) de 50 mM imidiazole, 50 mM de chlorure de potassium (KCl), 4 mM de chlorure de magnésium (MgCl 2), 2 mM d'éthylène-glycol d'acide tétraacétique (EGTA), pH 6,7. Filtre stérile et conserver à 4 ° C.
  4. Dissoudre biotinylé albumine de sérum bovin (BSA-biotine) à 2 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue.Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un mois.
  5. Dissoudre la streptavidine (SA) à 10 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 20 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines.
  6. Dissoudre α-caséine à 5 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines.
  7. Dissoudre dithiothréitol (DTT) dans de l'eau déminéralisée à 200 mM. Conserver à -20 ° C en aliquotes de 100 pi, utiliser dans les 8 heures de décongélation. Peut-être recongelé.
  8. Dissoudre le paclitaxel (PT) en HPLC du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 4 mM. Boutique en 10 aliquotes à -80 ° C à long terme, de -20 ° C à court terme. Utiliser dans les 8 heures suivant la décongélation. Peut-être recongelé.
  9. Dissoudre le glucose dans de l'eau désionisée à 120 mg / ml. Conserver dans aliquotes de 100 pi à -20 ° C. Peut-être recongelé.
  10. Disrésoudre l'adénosine triphosphate (ATP) dans de l'eau déminéralisée à 150 mM, pH 7,0. Boutique en 5 aliquotes à -80 ° C, utiliser dans les 8 heures de décongélation.
  11. Préparer stocks d'oxygène 100x balayage 25 par dissolution de 10.000 unités de glucose-oxydase et catalase 156.000 unités dans 600 ul du tampon de dosage total. Centrifuger brièvement dans une microcentrifugeuse à granulés solides; surnageant filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 10 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant une semaine.

2. Microtubules Gliding test, même Préparation de la solution Jour

Préparer les solutions de 02.01 à 02.06 le jour de l'expérience. Avec la pratique, les solutions de 2.2 à 2.6 peuvent être préparés pendant l'écoulement des cellules lavage. Sauf indication contraire, gardez solutions mères sur la glace.

  1. Préparer AB, 1 ml de tampon de dosage avec 10 ul de la TNT stock (AB avec 2 mM de DTT). Conserver à température ambiante.
  2. Préparer bio-BSA tampon, 40 & mu, L d'un mélange 1:1 du stock biotine-BSA et AB. Conserver à température ambiante.
  3. Préparer un tampon BSA, mélangeant 645 ul de AB avec 5,5 ul de BSA (1 mg / ml de BSA dans AB). Conserver à température ambiante.
  4. Préparer un tampon SA, en mélangeant 57 ul de AB avec 3 streptavidine actions ul (0,5 mg / ml de streptavidine dans AB). Conserver à température ambiante.
  5. Préparer α-caséine tampon, mélanger 200 pi de tampon BSA, 50 ul de stock caséine et 0,8 ul de 15 uM (1 mg / ml α-caséine, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM d'ATP dans AB) ATP. Conserver à température ambiante.
  6. Préparer la fluorescence anti-eau de Javel tampon, mélangeant 95 pl de tampon α-caséine, 2,5 ul de stock de glucose, 1 ul mélange d'oxygène 100x balayage, 1 stock paclitaxel pi, 1 pi 2-mercaptoéthanol (ßME). Ajouter ßME sous une hotte. Utilisez la fluorescence anti-eau de Javel tampon dans 1 h de préparation. ATTENTION: ßME est hautement toxique et sent mauvais. Assurez-vous d'être ouvert uniquement sous la hotte. Bouteille dans le magasinl'absence de lumière, la lumière dégrade ßME et sa capacité à réduire photoblanchiment.

3. Microtubules Gliding Assay

  1. Construire environ quatre voies d'écoulement entre une lamelle 24 x 60 mm et 22 mm x 22 lamelle avec de la graisse à vide, extrudés à partir d'une seringue à travers un embout de pipette, comme un élément d'espacement. Chaque voie d'écoulement doit être d'environ 10 pi en volume (échelle des volumes suivants en conséquence).
  2. Lavez 10 ul de bio-BSA tampon dans chaque couloir. Incuber 5 minutes pour permettre BSA pour revêtir les surfaces de verre.
  3. Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour enlever la biotine libre-BSA, tout en continuant à bloquer la surface de glissement. Utilisez un Kimwipe ou de papier filtre pour éliminer le tampon du côté opposé de chambre d'écoulement, en étant sûr de ne pas laisser de bulles d'air à passer par la chambre d'écoulement.
  4. Lavez 15 pi SA-tampon dans chaque couloir. Attendre 10 minutes, ou jusqu'à 2 heures. La streptavidine se lie à la biotine lié à la surface-BSA.
  5. Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour retirer gratuitement SA, tout en continuant de bloquer la surface de glissement.
  6. Laver chaque voie avec 15 ul de tampon α-caséine. α-caséine permet en outre de bloquer liaison non spécifique de la kinésine et des microtubules dans le verre.
  7. Diluer kinésine à 10 nM dans α-caséine tampon et laver chaque voie avec 15 ul de cette kinésine - α-caséine solution. Attendre 15 minutes (ou jusqu'à une heure) de la kinésine biotinylé de se lier spécifiquement à la streptavidine liée à la surface. Les domaines kinésine moteur resteront libres de lier les microtubules.
  8. Diluer le paclitaxel à 40 pM dans la température ambiante α-caséine tampons, et laver chaque voie avec 15 ul de cette solution pour laver la kinésine libre et de pré-charger chaque chambre d'écoulement avec une solution de paclitaxel pour éviter de dépolymérisation des microtubules. Froide dépolymérise également microtubules, alors assurez-vous que ces étapes se produisent à température ambiante avec salle de temre des solutions.
  9. Diluer marqué par fluorescence microtubules 1:100-1:1,000 de la fluorescence anti-eau de Javel tampon avec 1 mM d'ATP. Lavez 15 ul dans une voie et d'observer dans les 30 minutes.

4. Collecte des données

  1. Observez le glissement des microtubules en utilisant la microscopie à fluorescence, un microscope capable de résoudre fluorophores simples comme une installation commerciale ou maison de construction FRBR est nécessaire 26 (figure 2).
    Les microtubules devrait être propulsé par les moteurs de kinésine sur le substrat à environ 0,5 mm / s, en fonction de la température. Si le champ de vision du microscope est de 50 um, les microtubules individuels doit être visible pendant environ 100 secondes. Réglez l'intensité lumineuse de telle sorte que les fluorophores simples ne photoblanchiment plus vite que 100 sec. Si l'on utilise une excitation laser, un réglage de puissance de l'ordre de 3-5 mW est approprié.
  2. Recueillir des séquences d'images pour l'analyse. 600 images à5 Hz (2 min au total) fonctionne bien. Utiliser des séquences assez longtemps que les microtubules traversent l'ensemble du champ de vision.

5. Analyse des données

Une routine IDL, get_lp.pro , est annexé. Cette routine renvoie une valeur de longueur de persistance basée sur les microtubules glisse dans une séquence d'images donné. Soit exécuter cette routine sur chaque séquence d'images, la modification des paramètres d'intensité en fonction de la configuration de votre microscope particulier, ou procédez comme suit:

  1. Suivre chaque fluorophore attaché à un microtubule à créer des trajectoires fluorophores.
  2. Mélanger tous les trajectoires des fluorophores sur un microtubule donné dans une trajectoire globale des microtubules; répétez pour chaque microtubules dans la séquence d'images (figure 3).
  3. Calculer l'angle de la tangente à chaque point le long de la trajectoire (figure 4), Et calculer θ s> dans l'équation. 1 en faisant la moyenne du cosinus de la différence d'angle pour chaque paire de points séparés par un chemin de longueur l (figure 5). Trouver la longueur de persistance pour un microtubule ou un groupe de microtubules par θ s> à Eq. 1, la pondération des points de données individuels dans l'ajustement par le nombre de valeurs indépendantes du cos θ s qui sont utilisés pour calculer la moyenne.

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Résultats

Une image extraite d'un test de glissement est présentée dans la Figure 2. Une densité adéquate de microtubules correspond à 1-10 microtubules par champ observé ; une densité nettement plus élevée entraînera des erreurs de suivi lorsque les microtubules se croisent. Un graphique représentant les trajectoires de 11 microtubules issues du test de glissement de la Figure 2 est montré dans la Figure 3. Les trajectoires typiques ont une longueur de 10 à 30 μm ; certaines traj...

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Discussion

Les mesures de longueur de persistance sont une bonne caractérisation des propriétés mécaniques des biopolymères individuels. Dans cet article, nous avons décrit une méthode de mesure de la longueur de persistance des microtubules. Comme indiqué dans l'introduction, cette méthode est facilement étendu à l'examen des propriétés mécaniques des microtubules dans une variété de conditions tout simplement en faisant varier les réactifs, la température, la viscosité ou à l'étape finale de l'épreuve de glisse, ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Remerciements

Nous tenons à remercier Melissa Klocke d'assistance préparer la Figure 1 et Anna Ratliff pour démontrer le protocole. Ce travail a été soutenu par la Société pour l'avancement de la recherche scientifique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Réactifs
imidazoleSigma-AldrichI2399
chlorure de potassiumSigma-AldrichP9541
chlorure de magnésiumSigma-AldrichM8266
EGTASigma-AldrichE3889
BSACalbiochem126615
biotinylé BSAThermo Scientific29130
&alpha ;-caséineSigma-AldrichC6780
streptavidineThermo Scientific21125
dithiothreitolSigma-AldrichD0632
paclitaxelLC LaboratoriesP-9600
glucose oxydaseSigma-AldrichG2133
catalaseSigma-AldrichC100
glucoseSigma-AldrichG8270
ATPSigma-AldrichA2383
2-mercapt– ; thanolSigma-AldrichM3148Toxique. Achetez une petite quantité.
24X60 mm N° 1 1/2 verre de protectionVWR48393-252
22X22 mm N° 1 verre de protectionGold Seal3306
Graisse sous vide pousséDow-CorningNA
Equipment
microscope TIRFmanyNALe microscope TIRF utilisé dans cette méthode était fait maison.
IDL (logiciel)ExelisNAPourrait remplacer MATLAB, ImageJ ou d’autres logiciels d’analyse d’images.

Références

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