Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

Summary

Nous décrivons ici le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui permet l'imagerie microscopique continu et à haute résolution de cellules de levure en herbe simples lors de leur réplication complète et / ou chronologique durée de vie.

Abstract

Nous démontrons l'utilisation d'une configuration microfluidique simple, dans lequel les cellules de levure bourgeonnante simples peuvent être suivis tout au long de leur durée de vie. La puce microfluidique exploite la différence de taille entre les cellules de la mère et la fille en utilisant un tableau de micropads. Lors du chargement, les cellules sont piégées en dessous de ces micropads, parce que la distance entre le Micropad et le verre de couverture est similaire au diamètre d'une cellule de levure (3-4 pm). Après la procédure de chargement, le milieu de culture est constamment balayé par la puce, ce qui non seulement crée un environnement constant et défini tout au long de l'expérience, mais aussi de rincer les cellules filles émergents, qui ne sont pas retenues sous les patins en raison de leur petite taille. La configuration conserve les cellules mères si efficacement que dans une seule expérience jusqu'à 50 cellules individuelles peuvent être surveillés de façon entièrement automatisée pour 5 jours ou, le cas échéant, plus longtemps. En outre, les excellentes propriétés optiques de la puce permettent élevéImagerie de résolution des cellules au cours de la totalité du processus de vieillissement.

Introduction

Bourgeonnement levure est un organisme modèle important pour recherche sur le vieillissement ^1. Jusqu'à une date récente étude réplicative vieillissement des cellules de levure a été un processus laborieux nécessitant une méthode de dissection, dans lequel chaque bourgeon a été enlevé manuellement à partir de la cellule mère ^2,3. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment présenté une configuration microfluidique roman en mesure de suivre les cellules mères individuels tout au long de leur durée de vie ^4.

Dans notre puce microfluidique, les cellules de levure sont piégées sous micropads gazeuses à....

Protocol

1. Production et la préparation d'une plaquette moule en silicone

Puces microfluidiques sont créés à partir d'un moule de plaquette de silicium produite par lithographie douce. Ces plaquettes peuvent être réutilisés plusieurs fois pour produire des puces microfluidiques. Il est souhaitable que la production d'une tranche respective est réalisée par un groupe spécialisé dans la microfluidique ^6.

La plaquette est réalisée par un procédé de photolithographie deux étapes au moyen de deux couches différentes de résine photosensible négative, SU-8 ^7. La couche de fond est utilisée pou....

Results

Dans ce protocole, les cellules sont chargées dans la puce microfluidique directement à partir de la culture à mi-exponentielle. Pour déterminer si la répartition par âge des cellules piégées dans la puce microfluidique est similaire à celle de la culture avant le chargement, les cellules ont été colorées avec agglutinin de blé conjugué au FITC (WGA-FITC) pour visualiser les cicatrices de bourgeon. Comme on peut le voir dans la figure 3, le piégeage de cellules dans les micropads de la puce microfluidiq.......

Discussion

La méthode décrite ici microfluidique est un outil important de roman en recherche sur le vieillissement, car elle permet la production simple et automatisée de levure réplicatif données de durée de vie en combinaison avec l'imagerie en continu à haute résolution. Ces attributs sont les principales améliorations par rapport aux possibilités expérimentales de la méthode de dissection classique, mais il ya quelques limites de la méthode qui doit être pris en compte.

Notez que la durée de v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DC Sylgard 184 élastomère	Mavom bv	1060040	Ce paquet contient une base PDMS et un agent de durcissement PDMS.
Boîtes de Pétri en verre 120/20 mm	VWR International	391-2850
Verres de couverture 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
			d’aluminium
Gobelet
Pipette sérologique 5 ml	VWR International	612-1245
Scotch	tape VWR International	819-1460
Pâte de Baysilone (silicones GE Bayer)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
Tube de microbore en PTFE, 0.012"ID x 0.030"OD	Cole Parmer	EW-06417-11	Appelé tube mince
Tube de microbore Tygon, 0.030"ID x 0.090"OD	Cole Parmer	EW-06418-03	Scalpel
	VWR International	233-5334
Seringues Luer-Lok 50 ml	BD	300137
seringues de 5 ml, Embout Luer	VWR International	613-1599
Pince à épiler	VWR International	232-2132
Embouts Luer de calibre 20	Instech Solomon	LS20
Filtres à seringue (taille des pores 0,20 &mu ; m)	Sigma-Aldrich	16534K
Cathéter en acier inoxydable Plug, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Boîtes de Pétri	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
Benchtop Nettoyeur UV-Ozone	NOVA Scan	PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite	Harvard Apparatus	70-4505
SU-8 moule maître en silicone (wafer)			Fait maison ; Pour plus de détails, contactez l’auteur correspondant
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
Pompe à vide	KNF Neuberger	N022 AN.18
Dessiccateur	VWR International	467-2115
Plaque chauffante	VWR International	460-3267
En option : Support métallique pour verre de protection (22x40 mm)			Fait maison ; Pour plus de détails, contactez l’auteur correspondant
(Fluorescence) Microscope avec objectif 60x, autofocus, capacités time-lapse et de préférence un étage automatisé (contrôle XY motorisé)	Nikon	Eclipse Ti-E