Continue observation microscopique à haute résolution de réplicative vieillissement chez la levure de bourgeonnement

Summary

Nous décrivons ici le fonctionnement d'un dispositif microfluidique qui permet l'imagerie microscopique continu et à haute résolution de cellules de levure en herbe simples lors de leur réplication complète et / ou chronologique durée de vie.

Abstract

Nous démontrons l'utilisation d'une configuration microfluidique simple, dans lequel les cellules de levure bourgeonnante simples peuvent être suivis tout au long de leur durée de vie. La puce microfluidique exploite la différence de taille entre les cellules de la mère et la fille en utilisant un tableau de micropads. Lors du chargement, les cellules sont piégées en dessous de ces micropads, parce que la distance entre le Micropad et le verre de couverture est similaire au diamètre d'une cellule de levure (3-4 pm). Après la procédure de chargement, le milieu de culture est constamment balayé par la puce, ce qui non seulement crée un environnement constant et défini tout au long de l'expérience, mais aussi de rincer les cellules filles émergents, qui ne sont pas retenues sous les patins en raison de leur petite taille. La configuration conserve les cellules mères si efficacement que dans une seule expérience jusqu'à 50 cellules individuelles peuvent être surveillés de façon entièrement automatisée pour 5 jours ou, le cas échéant, plus longtemps. En outre, les excellentes propriétés optiques de la puce permettent élevéImagerie de résolution des cellules au cours de la totalité du processus de vieillissement.

Introduction

Bourgeonnement levure est un organisme modèle important pour recherche sur le vieillissement ^1. Jusqu'à une date récente étude réplicative vieillissement des cellules de levure a été un processus laborieux nécessitant une méthode de dissection, dans lequel chaque bourgeon a été enlevé manuellement à partir de la cellule mère ^2,3. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment présenté une configuration microfluidique roman en mesure de suivre les cellules mères individuels tout au long de leur durée de vie ^4.

Dans notre puce microfluidique, les cellules de levure sont piégées sous micropads gazeuses à base d'élastomère (voir Figure 1). Un flux continu de milieu emporte cellules filles nouvellement formés et fournit les cellules avec des nutriments frais. Dans une expérience unique, jusqu'à 50 cellules mères peuvent être contrôlés de manière entièrement automatique pendant toute leur durée de vie réplicative. En raison des excellentes propriétés optiques de la puce microfluidique, il est possible de surveiller simultanément les différents aspects de la biologie de la cellule de levure (par exemple, en utilisant des protéines fluorescentes).

Par rapport à la méthode de dissection classique, la configuration microfluidique offre des avantages substantiels. Elle assure un environnement déterminée et constante pendant toute l'expérience de vieillissement. Il ne nécessite aucun équipement spécialisé coûteux et peut être exécuté sur n'importe quel microscope équipé d'orientation automatisé et des capacités time-lapse ainsi que de contrôle de température pour la culture cellulaire. La production et le fonctionnement des puces microfluidiques peuvent être appris en quelques jours. En outre, les cellules peuvent être chargés directement à partir d'une culture en croissance exponentielle, un avantage sur une autre méthode microfluidique récemment publié ^5, qui nécessite biotinylation des cellules mères. ^Une Combiné avec imagerie à haute résolution, la méthode décrite ici peut être utilisé pour mesurer des changements progressifs dans la morphologie cellulaire, l'expression de protéines et de localisation au cours de la levure du vieillissement d'une manière sans précédent. La capacité desuivi à long terme de cellules individuelles offre également des possibilités uniques pour l'étude du cycle cellulaire de la levure.

Cette méthode ^a récemment été optimisée pour enlever la biotinylation du protocole ^16, qui a été publié alors que ce manuscrit était à l'examen.

Protocol

1. Production et la préparation d'une plaquette moule en silicone

Puces microfluidiques sont créés à partir d'un moule de plaquette de silicium produite par lithographie douce. Ces plaquettes peuvent être réutilisés plusieurs fois pour produire des puces microfluidiques. Il est souhaitable que la production d'une tranche respective est réalisée par un groupe spécialisé dans la microfluidique ^6.

La plaquette est réalisée par un procédé de photolithographie deux étapes au moyen de deux couches différentes de résine photosensible négative, SU-8 ^7. La couche de fond est utilisée pour générer la zone de piégeage de cellules (SU-8 2002; hauteur 3-4 pm), alors que les canaux sont réalisés avec la couche supérieure (SU-8 2010; hauteur 10 pm). Une impression du processus de production de plaquettes peut être trouvée dans Huang et al ^8. Les dessins des puces microfluidiques peuvent être obtenus auprès des auteurs ainsi que des conseils sur la façon d'obtenir une plaquette respective.

1. Une fois la plaquette est obtenue, couper un morceau de int Tough-Tago minces bandes d'environ 0,5 mm par 3 mm avec un scalpel et les placer soigneusement sur ​​la plaquette légèrement sur ​​le dessus de la structure de canal entre les canaux d'entrée et le réseau Micropad (figure 2A). Cela se traduira par la formation d'un grand canal supplémentaire dans chaque puce, qui permettra non seulement être utilisé pendant le chargement de la cellule, mais il est également important pour le fonctionnement stable du dispositif microfluidique.
2. Couvrir la boîte de Pétri en verre avec une double couche de papier d'aluminium et mettre la galette dans la boîte de Pétri. La feuille d'aluminium permet d'éviter PDMS de fonctionnement entre la plaquette et la boîte de Pétri. Si PDMS ne se glisser entre la plaquette et la boîte de Pétri en verre, la plaquette devient fixé de façon permanente dans la boîte de Pétri. Bien que la plaquette est encore utilisable, il ne sera pas possible de remplacer la boîte de Pétri en verre si ça casse et le PDMS devra être coupé par la suite.

2. La production de puces microfluidiques

1. Placez un plastique videtasse sur la balance et tarer la balance. Verser 40 g de base PDMS dans le gobelet en plastique (pour un cm de diamètre en verre de Pétri 12). Ajouter PDMS durcisseur avec une pipette dans un rapport p / p de 1:10, soit environ 4 ml.
2. Mélanger le PDMS et durcisseur à fond pendant plusieurs minutes. Cela peut être fait avec la pipette jetables en plastique qui a servi à la pipette l'agent de durcissement. Il est important que le mélange soit bien mélangé avant d'être coulée sur le dessus de la galette. Mauvais mélange fera partie du PDMS ne se polymériser.
3. Verser le PDMS sur le dessus de la galette dans la boîte de Pétri en verre.
4. Le mélange de PDMS avec l'agent de durcissement va conduire à la formation de bulles dans le mélange PDMS. Ces bulles doivent être retirés avant le PDMS polymérise. Le PDMS peut être dégazé après la coulée sur le dessus de la plaquette en plaçant la boîte de Petri dans un dessiccateur relié à une pompe à vide. Avec cette configuration, il faut environ 30 minutes pour éliminer toutes les bulles du mélange.
5. Polymériser ee PDMS en plaçant la boîte de Pétri avec la galette sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 1 h, puis à 65 ° C pendant une heure.
6. Retirer la feuille d'aluminium ainsi que la tranche et le PDMS polymérisé à partir de la boîte de Pétri en verre. Enlever la feuille d'aluminium et la couche mince de résidu polymérisé PDMS de l'arrière de la plaquette. La couche de PDMS sur le dessus de la tranche peut alors être séparé de la plaquette en la soulevant avec soin.
7. Placez la couche de PDMS à l'envers (avec les canaux vers le haut) sur le banc et découpez les modèles de puce unique imprimé sur le PDMS soigneusement avec un scalpel. Essayer de conserver l'ordre de 3 mm de PDMS autour des bords des canaux afin d'améliorer la fixation de la puce sur le verre de recouvrement par la suite.
8. Percer des trous dans le PDMS aux extrémités de la goulotte d'entrée, de sortie et de côté (figure 2A) en poussant un tronçon Luer de calibre 20 tout le long du PDMS de façon rectiligne.

Assurez-vous que la puce PDMSest toujours couché à l'envers sur le banc tandis que poinçonnage des trous. Ceci empêche PDMS de coller à l'intérieur du canal, ce qui pourrait provoquer un blocage du canal.

9. Après avoir percé chaque trou, enlever la colonne de PDMS dans le talon luer avec des pincettes avant de tirer le talon de nouveau. La colonne PDMS pourrait autrement rester derrière et de bloquer le trou juste poinçonné.
10. Nettoyer les surfaces de la puce à partir de particules de poussière et PDMS résiduelle en plaçant du ruban adhésif sur elle et enlever immédiatement de nouveau la bande. De même nettoyer le verre de protection à laquelle la puce sera jointe.
11. Placez la puce nettoyé et couvercle en verre en dessous de la lampe UV de la paillasse Cleaner UV-Ozone. Les parties qui doivent être liés ensemble doivent faire face à la lampe.
12. Exposer le PDMS et couvrir verre à la lumière UV pendant 6-8 min, et directement après, mettre la puce de la vitre de protection en plaçant les surfaces exposées au-dessus de l'autre.
13. Tapoter légèrement sur les côtés de la pucefavoriser la participation du PDMS pour le verre de couverture et d'éliminer les bulles d'air. Ne tapez pas sur le dessus de la structure de canal car cela pourrait provoquer des micropads de s'attacher à la vitre de protection ainsi.
14. Placez la configuration microfluidique nouvellement faite sur une plaque chauffante à 100 ° C pendant 60 min. Testez la force de la liaison entre le couvercle en verre et puce PDMS en essayant de soulever les bords de la puce PDMS légèrement. Lorsque le bloc PDMS ne peut être levée à partir de la surface du verre, la liaison est réussi et la puce est prêt à l'emploi.

3. Préparation de la puce pour portable Chargement en cours

Défaillance d'un dispositif microfluidique peut potentiellement provoquer des fuites de fluide dans le microscope. Pour éviter cela, il est consultatif d'utiliser un support de métal et / ou sceller les côtés de la puce où le PDMS rencontre le verre avec vernis ou de colle époxy. Cela empêche les fuites de fluide dans le cas où la puce PDMS n'est pas lié assez bien pour le verre de protection. Aussi le tubeconnexions peuvent être fixés autour des points d'insertion de la même manière à éviter toute fuite de fluide. Un capteur d'eau fait maison qui éteint la pompe seringue en cas de fuite peut être utilisé comme une mesure de sécurité supplémentaire. Dessins du support métallique spécialement conçu pour la puce microfluidique peuvent être obtenus auprès des auteurs.

1. Placer la puce microfluidique dans le support en métal, avec un gel de silicone entre la vitre de la puce et les parties métalliques du support pour créer un joint étanche à l'eau. Visser les écrous doucement, pour ne pas briser le verre.
2. Connecter des tubes minces (environ 5 à 15 cm de long) vers le canal latéral et le canal de sortie de la puce. L'utilisation de la pince, il est facile d'insérer le tube dans les trous perforés.
3. Remplir une seringue de 50 ml Luer-Lok avec un milieu de culture, enlever l'air de la seringue et le connecter de manière séquentielle à un filtre de seringue, un talon Luer de calibre 20, un gros tube court (environ 2 cm de long) et un tube mince. Assurez-vous que la baignoire mincee est suffisamment longue pour couvrir la distance entre la pompe à seringue et la platine du microscope.
4. Placer la seringue dans la pompe à seringue, l'avance rapide de la pompe jusqu'à ce que le tube mince est entièrement remplie de fluide.
5. Poussez le tube mince relié à la seringue dans le canal d'entrée de la puce et de laisser le débit moyen à travers la puce à 10 pi / min (figure 2B). Recueillir le moyen de quitter la puce (par exemple dans une boîte de Pétri). Le milieu sera épuisé par l'intermédiaire du canal latéral à cause de la différence de résistance entre la dure-Tag fait grand canal latéral et le canal de sortie.
6. Placez la puce à l'étape de microscope et mettre l'accent sur le microscope sur les pads.

L'utilisation d'objectifs à immersion d'huile est préférable à celle des objectifs à immersion de l'eau parce que l'huile ne sèche pas sur le temps long de l'expérience.

Selon le microscope qu'il pourrait y avoir des problèmes avec maintien de la fOCUS pendant les premières heures de l'expérience. Il est donc conseillé de laisser la puce pendant une à deux heures dans la platine du microscope afin qu'il puisse s'installer avant que les cellules de chargement et de commencer l'expérience.

4. Chargement des cellules de levure dans la puce microfluidique

1. Connectez un ml Luer seringue à embout 5 à un talon Luer de calibre 20 et un tube épais (environ 3 cm).
2. Prélever un échantillon de la culture cellulaire doit être chargé dans la puce.

Le nombre de cellules le plus pratique pour le chargement est entre 1-5 x 10 ⁶ cellules par ml. Cultures avec le nombre de cellules plus élevées doivent être dilués avant le chargement. Lorsque la culture de cellules sur YPD, l'efficacité de chargement de la cellule peuvent être améliorés de nombreuses fois si les cellules sont d'abord lavées et remises en suspension avec dans un milieu minimal contenant un pourcentage de glucose similaire avant le chargement. Pendant le fonctionnement de la puce, milieu YPD peut de nouveau être utilisé en toute sécurité.

3. Charge d'environ 1 ml de la suspension cellulaire dans ee seringue et retirer tout l'air de la seringue.
4. Diminuer le débit de la pompe à seringue à 0,5 ul / min. Le faible débit et continue appliquée par la pompe de seringue pendant le chargement (à l'étape 4.5) va pousser des cellules non attachées par l'intermédiaire de la chaîne latérale (figure 2C).
5. Raccorder la seringue contenant la suspension cellulaire sur le tube de la voie de sortie. Charger les cellules en appuyant sur le piston de la seringue en douceur. Respecter les cellules entrent et s'installer sous les micropads via l'oculaire ou via l'écran de l'ordinateur.
6. Maintenir la pression sur le piston jusqu'à ce que suffisamment de cellules s'installent sous les patins. La charge optimale est de 1-3 cellules par bloc. Comme les cellules se déposent sous les patins au hasard, il est assez fréquent que quelques blocs ne contiennent pas de cellules et d'autres blocs sont complètement remplis de cellules.
7. Déconnecter la seringue utilisée pour le chargement de la pile et le tube épais qui lui est connecté dans le mince tube du canal de sortie, rincer le CH latéraleAnnel pour un couple de minutes à des débits plus élevés (10 pi / min) pour éliminer les bulles d'air et / ou des cellules qui n'ont pas encore sortent de la puce (figure 2B). Si les cellules ne sont pas retirés du canal latéral, ils peuvent commencer à croître dans le canal latéral et interférer avec l'expérience plus tard.
8. Mettre le débit de la pompe de la seringue vers le bas à 0,5 ul / min et de fermer le canal de côté large en le connectant à un tube d'épaisseur (environ 5 cm de long) contenant un connecteur de cathéter à son extrémité (figure 2D).
9. Augmenter le débit à un débit d'écoulement final de 5.1 pi / min. Les débits peuvent varier en fonction du fluide et de la souche de levure.
10. Lancer un film avec les réglages du microscope et de la caméra appropriés pour le but de l'expérience. S'assurer que la vitesse de la platine du microscope est réglé sur une vitesse faible que l'huile peut suivre. Pour la détermination de la durée de vie réplicative, les cellules d'image toutes les 10 min. Pour protéger les cellules contre les infimes quantités de lumière UV émis par l'halogènelampe, qui est utilisé lors de l'acquisition DIC, il est recommandé de placer un filtre UV supplémentaire dans le trajet de la lumière. Lorsque vous utilisez la microscopie à fluorescence, il est préférable d'image, les cellules moins fréquemment (par exemple toutes les 20 minutes) pour éviter les effets phototoxiques. L'expérience est terminée lorsque toutes les cellules chargées au début de l'expérience sont morts, qui dans des conditions normales peut prendre jusqu'à 5 jours. Il est recommandé de vérifier régulièrement la mise au point des images lors de l'expérience et si nécessaire ajuster.

Results

Dans ce protocole, les cellules sont chargées dans la puce microfluidique directement à partir de la culture à mi-exponentielle. Pour déterminer si la répartition par âge des cellules piégées dans la puce microfluidique est similaire à celle de la culture avant le chargement, les cellules ont été colorées avec agglutinin de blé conjugué au FITC (WGA-FITC) pour visualiser les cicatrices de bourgeon. Comme on peut le voir dans la figure 3, le piégeage de cellules dans les micropads de la puce microfluidiq...

Discussion

La méthode décrite ici microfluidique est un outil important de roman en recherche sur le vieillissement, car elle permet la production simple et automatisée de levure réplicatif données de durée de vie en combinaison avec l'imagerie en continu à haute résolution. Ces attributs sont les principales améliorations par rapport aux possibilités expérimentales de la méthode de dissection classique, mais il ya quelques limites de la méthode qui doit être pris en compte.

Notez que la durée de v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DC Sylgard 184 élastomère	Mavom bv	1060040	Ce paquet contient une base PDMS et un agent de durcissement PDMS.
Boîtes de Pétri en verre 120/20 mm	VWR International	391-2850
Verres de couverture 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
			d’aluminium
Gobelet
Pipette sérologique 5 ml	VWR International	612-1245
Scotch	tape VWR International	819-1460
Pâte de Baysilone (silicones GE Bayer)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
Tube de microbore en PTFE, 0.012"ID x 0.030"OD	Cole Parmer	EW-06417-11	Appelé tube mince
Tube de microbore Tygon, 0.030"ID x 0.090"OD	Cole Parmer	EW-06418-03	Scalpel
	VWR International	233-5334
Seringues Luer-Lok 50 ml	BD	300137
seringues de 5 ml, Embout Luer	VWR International	613-1599
Pince à épiler	VWR International	232-2132
Embouts Luer de calibre 20	Instech Solomon	LS20
Filtres à seringue (taille des pores 0,20 &mu ; m)	Sigma-Aldrich	16534K
Cathéter en acier inoxydable Plug, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Boîtes de Pétri	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
Benchtop Nettoyeur UV-Ozone	NOVA Scan	PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite	Harvard Apparatus	70-4505
SU-8 moule maître en silicone (wafer)			Fait maison ; Pour plus de détails, contactez l’auteur correspondant
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
Pompe à vide	KNF Neuberger	N022 AN.18
Dessiccateur	VWR International	467-2115
Plaque chauffante	VWR International	460-3267
En option : Support métallique pour verre de protection (22x40 mm)			Fait maison ; Pour plus de détails, contactez l’auteur correspondant
(Fluorescence) Microscope avec objectif 60x, autofocus, capacités time-lapse et de préférence un étage automatisé (contrôle XY motorisé)	Nikon	Eclipse Ti-E