Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

Clemens Köhncke; Ulrike Lisewski; Leonhard Schleußner; Carolin Gaertner; Saskia Reichert; Torsten K. Roepke

doi:10.3791/50145

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Article de méthode

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

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DOI :

10.3791/50145

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12 mars 2013

Clemens Köhncke¹^,² , Ulrike Lisewski¹ , Leonhard Schleußner¹ , Carolin Gaertner¹ , Saskia Reichert¹ , Torsten K. Roepke¹^,³

¹Experimental and Clinical Research Center (ECRC), Charité Medical Faculty and Max-Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), ²Medical Department, Division of Cardiology, Campus Virchow-Klinikum, Charité - Universitätsmedizin Berlin, ³Medical Department, Division of Cardiology and Angiology, Campus Mitte, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Dans cet article

Résumé

Dysfonctionnement des canaux Kv est associée à des arythmies cardiaques. Afin d'étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent à des arythmies telles que nous utilisons un protocole systématique pour l'isolement des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires chez des souris knock-out canaux Kv auxiliaires sous-unités. Cardiomyocytes isolés peuvent alors être immédiatement utilisé pour les études électrophysiologiques cellulaires, biochimiques ou immunofluorescence (IF) essais.

Résumé

Gènes codent KCNE pour une petite famille de sous-unités de canaux Kv auxiliaires qui forment des complexes avec des sous-unités hétéromériques Kv canal alpha de modifier leurs propriétés fonctionnelles. Des mutations dans les gènes KCNE ont été trouvés chez les patients souffrant d'arythmies cardiaques telles que le syndrome du QT long et / ou la fibrillation auriculaire. Cependant, la physiopathologie moléculaire précise qui mène à ces maladies reste insaisissable. Dans des études précédentes, les propriétés électrophysiologiques de la maladie provoquant des mutations dans ces gènes ont surtout été étudiée dans des systèmes d'expression hétérologues et nous ne pouvons pas être sûr si les effets rapportés peuvent être directement traduits en cardiomyocytes natifs. Dans notre laboratoire, nous utilisons donc une approche différente. Nous étudier directement les effets de la délétion du gène KCNE dans les cardiomyocytes isolés de souris knock-out par électrophysiologie cellulaire - une technique unique que nous décrivons dans ce numéro de la Revue des expériences visualisées. Les cœurs de geneticasouris KCNE lly modifiées sont rapidement excisé et monté sur un appareil de Langendorff par canulation aortique. Ca ^{2 +} libre dans le myocarde est lié par l'EGTA, et la dissociation des myocytes cardiaques est alors réalisée par perfusion rétrograde des artères coronaires avec un faible spécialisée Ca ^{2 +} tampon contenant de la collagénase. Atria, paroi libre du ventricule droit et le ventricule gauche peut alors être séparés par des techniques de microchirurgie. Le calcium est ensuite ajouté lentement vers les cardiomyocytes isolés dans une étape multiple comprenant procédure de lavage. Cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires d'apparence saine sans contractions spontanées sont alors immédiatement soumis à des analyses électrophysiologiques par la technique de patch-clamp ou d'autres analyses biochimiques au cours des 6 premières heures qui suivent l'isolement.

Protocole

1. L'anesthésie des animaux et des prélèvements d'organes

Anesthésier la souris par voie intrapéritonéale (ip) d'injection de kétamine (200 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (20 mg / kg de poids corporel).
Pour anticoagulation injecter 250 UI d'héparine ip pour éviter la formation de thrombus et la coagulation du sang.
Attendre jusqu'à ce que la narcose profonde est atteinte, qui est caractérisé par une aréflexie. Pour vérifier les réflexes de test aréflexie, la cornée par un léger toucher la cornée ou réflexe vol d'essai par pincement de la queue.
Transférer la souris sur table d'opération et le fixer en position couchée.
Inciser la peau et la paroi abdominale au-dessous de l'appendice xiphoïde et effectuer une thoracotomie preneuse: étendre la coupe de part et d'autre le long de l'arc costal et ensuite couper nervures dans la ligne axillaire médiane, dévier vers le haut la cage thoracique.
Ouvrez le péricarde, localiser gros vaisseaux. Appuyez doucement sur caudale cœur pour mieux afficher l'aorte. Serrer l'aorte aide d'une pince.
Placer le coeur dans la concavité d'une paire de s ciseaux et disséquer tous les navires de connexion avec une seule coupe. Assurez-vous de conserver une partie assez grande de l'aorte ascendante pour la ponction de Langendorff.
Transfert cœur excisé immédiatement à une boîte de Pétri remplie de glace froide et pré-oxygéné solution 1 (pour les solutions, voir le tableau 1).

2. Préparation de la perfusion cardiaque et Langendorff

Cathétériser l'aorte avec une canule en acier 1.8F. Assurez-vous d'éviter une embolie gazeuse.
Fixer l'aorte sur la canule avec une suture chirurgicale et coronaires rincer avec 1 ml de solution à 1.
Connectez canule avec un appareil de Langendorff.
Assurez-vous que le temps d'une thoracotomie pour canulation Langendorff ne dépasse pas 120 secondes pour éviter prolongée d'ischémie / reperfusion du myocarde.
Coeur perfuse avec 10 ml de solution de Ca ^{2 +} libre 2 (4 ml / min).
Coeur perfuser avec une solution de collagénase 3 pour 8 min (4 ml / min).

le "> 3. microchirurgicale dissociation des chambres cardiaques

Coeur de transfert dans un préchauffé à 100 mm boîte de Pétri contenant une faible solution de Ca ^{2 +} 4.
Retirez délicatement l'aorte et d'autres non cardiaque tissu avec des ciseaux et jetez-le.
Oreillettes et les ventricules séparés et continuent à chaque chambre séparément. Gardez les cellules immergées dans la solution 4. Utilisez de petits volumes (moins de 5 ml).

4. La dissociation des cardiomyocytes plus

Cardiomyocytes auriculaires:
1. Pour individualiser les cardiomyocytes auriculaires transférer les oreillettes dans un séparé préchauffé boîte de culture de 100 mm et dissocier le tissu à travers le tirant doucement à part avec une pince fine. Veiller à une dissociation presque complète du tissu.
2. Utiliser une pipette de 1 ml avec un plus polie au feu embout de pipette en plastique pour suspendre les cellules dans 1 ml de solution à 5 pendant 5 min.
3. Séparer les cellules de débris à l'aide d'un filtre de cellules (200 um de maille).
4. Ajouter 5 ml de solution 5 à la suspension de cellules et centrifuger 2 min à 16 xg à température ambiante.
5. Les étapes suivantes sont conduites sous une hotte de culture cellulaire. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de solution à 6.
6. Après sédimentation par gravité pendant 10 min dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 1 min à 16 xg à température ambiante. Enlever le surnageant. Remettre en suspension les cellules en fonction de leur quantité dans 1-5 ml de solution à 6.
Cardiomyocytes ventriculaires:
1. Disséquer la région du ventricule gauche d'intérêt avec une pince fine dans 5 ml de la solution 4.
2. Suspendre les cellules en pipetant doucement jusqu'à ce que la plupart des cellules sont séparées. Transférer la solution cellule après filtrage (200 maillage um) dans un tube de 50 ml, ajouter un volume de 25 ml.
3. Centrifuger pendant 2 minutes à 16 xg à température ambiante.
4. Les étapes suivantes sont conduites sous une hotte de culture cellulaire. Retirer le surnageant, remettre en suspension le culot dans 25 ml d'6 solution et de permettre une sédimentation des cellules pendant 10 min.
5. Compter les cellules et éliminer le surnageant, ajouter 25 à 50 ml de solution 6 sur les cellules.

5. Préparation des cardiomyocytes pour cellulaire électrophysiologie, biochimie ou si les études

Pour les études d'électrophysiologie, garder les myocytes en solution à 6 dans un tube de 50 ml et empêcher la sédimentation.
Pour les études biochimiques, d'imagerie de calcium, par exemple, les myocytes plaque sur la laminine plat recouvert de culture cellulaire (concentration finale 20 pg / ml de laminine dans du PBS).
Pour immunofluorescence préparer une plaque de culture cellulaire plat avec des lamelles de verre et enduit avec une solution de laminine (concentration finale de 50 pg / ml de laminine dans du PBS).
1. Retirer la solution avant de myocytes de placage. Plaque les cellules et contrôler la densité de cellules à l'aide d'un microscope.
2. Laissez les myocytes adhérer à lamelle pendant 1 heure à 37 ° C dans 2% de CO _2, enlever la solutionet à lancer immédiatement un protocole procédure de coloration standard.
3. Incuber avec un fixateur, par exemple 4% de PFA dans du PBS (pH 7,5) pendant 10 min à température ambiante et de suivre avec PBS trois étapes de lavage pour 5 min chacun.
4. Pour perméabiliser les cellules et d'inhiber la liaison non spécifique d'anticorps incuber les myocytes avec 10% de sérum, Triton 0,3%, BSA 0,2% dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
5. Incuber avec l'anticorps primaire pendant 1 heure à 37 ° C et laver comme indiqué auparavant.
6. Incuber avec l'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante. Pour contre-coloration des noyaux et l'utilisation α-actinine fluorochrome DAPI et phalloïdine conjugué (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
7. Après le lavage, transférer le couvercle en verre glisse prudemment sur des lames de microscope silane traitées et les cellules embed dans un milieu de montage fluorescence.

6. Electrophysiologie cellulaire

Effectuer cellules entières patch-clamp sur la fréquenceshly isolé cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires à la température ambiante.
Transférer en bonne santé cardiomyocytes apparaissant dans la chambre de perfusion remplie d'un volume défini de solution de bain extracellulaire. 117 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1 mM KH ₂ PO _{4, 4} mM NaHCO _3, 1,7 mM MgCl _2, 3 mM de CoCl _2, 10 mM HEPES, 10 mM de glucose et 0,02 mM tétrodotoxine (TTX), (pH 7,4) . Utilisez NaOH pour ajuster le pH.
Utiliser un matériel de patch-clamp (c.-à-IX71 microscope inversé, un amplificateur Multiclamp 700B, un système d'acquisition Digidata 1440A et PC avec le logiciel pClamp10.3 (Molecular Devices)).
N'utiliser que des pipettes de patch avec des résistances de 3-5 MQ quand il est rempli avec une solution intracellulaire contenant 130 mM de KCl, ₂ mM de MgCl2, 11 mM HEPES, 11 mM d'EGTA 5 mM Na ₂ ATP, 0,4 mM Na ₂ GTP, 5 mM Na ₂ CP et 4,9 mM de CaCl ₂ (pH 7,2). Utilisez KOH pour l'ajustement du pH.
Evoke courants K + vers l'extérieur duescaliers du ring tension de 4,5 sec pour tester des potentiels compris entre -60 et +50 mV à 10 mV par incréments de-un potentiel de maintien de -70 mV après un intervalle de 20 ms à -40 mV prepulse.
Assurez-vous que les courants de fuite sont toujours <100 pA.
Pour la dissection de K + différents courants utiliser des inhibiteurs spécifiques tels que le 4-aminopyridine (4-AP, ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) ou tétraéthylammonium (TEA; Sigma). Les solutions mères doivent être préparés en solution de bain extracellulaire, et appliqué directement sur le voisinage le plus proche possible de la cellule via une micropointe après «de base» des enregistrements. L'équilibrage devraient être autorisés pendant 2-3 min avant «drogue» des enregistrements.
Pour l'analyse de normaliser les amplitudes de courant dans des cellules individuelles à la taille des cellules (capacitance de la membrane de cellule entière). Analyser les données hors connexion en utilisant le logiciel pClamp10.3 (Molecular Devices) ou un logiciel comparable.