Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Résumé

Nous présentons une technique pour l'étiquetage des neurones simples dans le système nerveux central (SNC) de Drosophila Embryons, ce qui permet l'analyse de la morphologie neuronale soit par lumière transmise ou microscopie confocale.

Résumé

Dans cet article, nous décrivons comment étiqueter individuellement les neurones dans le SNC embryonnaire de Drosophila melanogaster par injection juxtacellulaire de la membrane lipophile Dil marqueur fluorescent. Cette méthode permet la visualisation de la morphologie des cellules neuronales dans les moindres détails. Il est possible de marquer n'importe quelle cellule du système nerveux central: les corps cellulaires des neurones cibles sont visualisés sous une optique DIC ou par expression d'un marqueur fluorescent génétique comme la GFP. Après marquage, le DiI peut être transformée en une tache brune permanente par photoconversion pour permettre la visualisation de la morphologie des cellules avec de la lumière transmise et de l'optique DIC. Alternativement, les cellules Dil-marqués peuvent être observés directement par microscopie confocale, permettant génétiquement introduits protéines rapporteurs fluorescents à colocalised. Cette technique peut être utilisée dans n'importe quel animal, quelle que soit le génotype, ce qui permet d'analyser les phénotypes mutants à résolution cellule unique.

Introduction

La connaissance de la morphologie neuronale au niveau des cellules individuelles est une condition essentielle pour la compréhension de la connectivité neuronale et la fonction du système nerveux central. Ainsi, dès les premiers jours de la neuroscience, les chercheurs ont cherché à développer des simples techniques de marquage de cellules (voir ⁷ pour un traitement historique de cette question). Les méthodes classiques comme la coloration de Golgi fournir une excellente résolution de la morphologie neuronale, mais ne sont pas adaptés si l'on cherche à identifier un type particulier de neurone d'une manière dirigée, que la coloration se produit de ....

Protocole

Nous avons utilisé deux variantes légèrement différentes de la méthode de marquage seul neurone dans nos laboratoires. Les différences portent sur ​​la collecte d'embryons, dechorionisation, devitellinisation et les étapes de filetage embryons. Figure 1 donne un aperçu des étapes communs et divergents des variantes.

1. Préparation des micro-aiguilles pour dissection de l'embryon et Micropipettes pour injection Dye

1. Aiguilles de verre pour la dissection d'embryons sont issus de capillaires en verre (1 mm de diamètre et de 0,1 mm d'épaisseur) avec un extracteur Sutter (Science Instruments) ou un éq....

Résultats

La figure 4 illustre les résultats typiques de la technique, que nous décrivons ici. Figure 4A montre un exemple de Dil interneurone unique rempli qui a été proprement photoconverted. Il démontre bien le niveau de détail de ces préparatifs offre. Lorsqu'elle est vue sous une optique DIC le contexte spatial de la cellule marquée dans le tissu environnant non marqué est visible, par exemple, la position du corps de la cellule à l'intérieur de l'écorce et de la project.......

Discussion

Un avantage majeur de la drosophile comme modèle de système est qu'il permet l'analyse du développement et de la fonction au niveau des cellules individuelles. Ceci est particulièrement utile en ce qui concerne le système nerveux, où la diversité des types de cellules est exceptionnellement élevé et la fonction et la morphologie des cellules voisines peut être totalement différente.

Procédé nous présentons ici permet le marquage des neurones individuels avec un colorant qui .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			REACTIFS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg / ml dans 100 mM Tris-HCl, pH 7,4
Dil	Sondes Invitrogen / moléculaires	D-282	1 mg / ml dans de l'éthanol
Formaldéhyde	Merck Millipore		7,4% dans du PBS
Glycérol	Roth	3783	70% dans du PBS
Heptane colle	Beiersdorf AG	Violoncelle 31-39-30 *	diluer env. 1 à 1 avec du n-heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			ÉQUIPEMENT
Microscope confocal	Leica	TCS SP2	de visualiser et de documenter les marquages ​​en fluorescence
DC - unemplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	pour effectuer les marquages
Lamelles de	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Lamelles de	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Microscope à dissection	Leica	MZ8	de préparer et de disect embryons
Plat capillaires	Hilgenberg		le diamètre extérieur de 1 mm, épaisseur 0,1 mm verre
Injection capillaires	Science Products	100 Go TF 8P
R micromanipulateur	Leica		pour effectuer les marquages
Modèle P-97	Sutter Instruments		de tirer capillaires
Diapositives Objets	Marienfeld supérieure	1000000
Microscope scientifique	Zeiss	Axioskop 2 mot	pour voir les marquages ​​après photoconversion
Microscope scientifique	Olympe	BX50	pour effectuer les marquages
Caméra vidéo Sony MC3255	Sony / AVT Corne	Sony MC3255	pour enregistrer marquages ​​après photoconversion

Tableau 1.